培养细胞的观察和检测方法.pptVIP

1、细胞固定的基本方法固定组织、细胞的目的：固定组织、细胞的原则：把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等；同时，固定还可以使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。固定前的准备：各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。悬浮细胞：离心（800～1000r/min）→PBS/Hanks漂洗2～3次贴壁细胞：用镊子轻轻取出盖片→PBS/Hanks漂洗2～3次注：漂洗的目的是去除血清和附着于细胞表面的残渣，防止其妨碍染色。简单固定液：甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、戊二醛、苦味酸、重铬酸钾、锇酸等混合固定液：甲醇/醋酸固定液、FAA固定液、Carnoy固定液、Bouin固定液、4％多聚甲醛-PBS固定液等甲醇/醋酸固定液：甲醇：冰醋酸为3：1，现用现配，适用于Giemsa染色。FAA固定液：90mL80％酒精＋5mL冰乙酸＋5mL40％甲醛，适用于盖片单层培养的细胞，固定效果好。Carnoy固定液：较好的非水溶性固定液，60mL纯酒精＋30mL氯仿＋10mL冰乙酸，适用于显示细胞化学成分。常用固定液2、细胞常用的染色方法H.E（苏木精-伊红）染色法原理：碱性染料苏木精和酸性染料伊红分别与细胞核和细胞质发生反应，使细胞的微细结构通过颜色而改变它的折射率，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞的图像，并能提供良好的核浆对比染色。染液配制：染色步骤：染色结果：细胞核染成红色，细胞质染成蓝色。母液配制：Giemsa粉0.5g，甘油22mL，将Giemsa粉置于研钵内先用少量甘油与之充分混合，研磨至无颗粒；然后将剩余甘油混在一起，56℃保温2h后，加入33mL纯甲醇，混匀，即为Giemsa母液，保存于棕色瓶内。染液配制：取9份pH6.8~7.38的Sorensen缓冲液和1份Giemsa母液混合即可。染色步骤：细胞标本用甲醇/醋酸固定液固定30min后，用滴管把染液布满玻片上，染色10~15min，用自来水冲去多余染液，空气干燥，二甲苯同名，光学树脂封固。12345注意事项：染液宜现配现用，保存时间最好不用超过48h，Giemsa对pH极敏感，缓冲液pH要调准确。染色结果：细胞核染成红色，细胞质染成蓝色。Giemsa（吉姆萨）染色法3、细胞特殊的染色方法Feulgen染色法1Coomassie染色法2PAS反应法3油红O（oilredO）法4免疫荧光染色法5免疫酶染色法6原理：在60℃条件下，DNA分子中的嘌呤碱和脱氧核糖的连键可被1mol/L盐酸水解打开，游离出的脱氧核糖醛基能与希夫（Schiff）试剂结合，形成紫红色复合物。在此过程中，RNA不受影响，故染色具DNA特异性。准确的温度和盐酸浓度，适宜的水温、时间是成功的关键。水温过度或不足均降低染色强度。此法能对DNA进行特异性染色试剂配制：1mol/LHCL：浓HCL8.5ml＋蒸馏水91.5mlSchiff试剂：母液装入棕色瓶，盖紧，黑纸包裹置于暗处染色过程：选用Carnoy固定液染色结果：细胞核染成粉红色至紫红色，胞质为无色。原理：显示细胞骨架、细胞内微丝的染色方法试剂配制：固定液：0.1mol/LNaH2PO4·2H2O14.0mL＋0.1mol/LNa2HPO4·12H2O36.0mL＋蒸馏水50.9mL＋25％戊二醛50.0mL染色液：甲醇46.5mL＋冰醋酸7.0mL＋考马斯亮蓝0.02g染色过程：染色结构：细胞内的微丝呈现蓝色。过碘酸席夫反应法

（periodicacidSchiffreaction，PAS）原理：过碘酸是一种强氧化剂，能将葡萄糖的乙二醇基（CHOH-CHOH）氧化成两个游离的醛基，它们与Schiff试剂反应生成紫红色产物。细胞内糖类的染色方法染色过程：试剂配制：染色结果：细胞含糖原区呈紫红色。2341细胞内脂类的染色方法苏丹（Sudan）Ⅲ/Ⅳ法苏丹黑法Lillie油红O（oilredO）法Cain硫酸尼罗蓝（Nile）法锇酸（osmicacid）法油红O（oilredO）法优点：油红O染色的脂肪比苏丹Ⅲ法染的颜色要深，对微小的脂滴易于显示，而且沉淀较少。10％中性甲醛溶液的配制﹙pH7.0﹚：量取37％~40％甲醛20mL，蒸馏水180mL，加入0.8g磷酸二氢钠﹙NaH2