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DNA条形码鉴定茄属种质技术规程

本标准规定了DNA条形码鉴定茄属种质的术语和定义、原理、仪器设备与主要试剂耗材、溶液配制、DNA条形码引物、DNA条形码序列、参照种质、DNA条形码序列的获取和DNA条形码比对及结果判定。

1范围

本标准适用于茄属种质栽培茄（Solanummelongena）、水茄（S.torvum）、喀西茄（S.aculeatissimum）

和蒜芥茄（S.sisymbriifolium）DNA条形码的测定、结果比对分析与判定。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

2.1

待测种质testedgermplasm

待鉴定的疑似栽培茄、水茄、喀西茄或蒜芥茄种质，由送检人提供。

2.2

参照种质referencegermplasm

用于与待测种质进行PCR扩增片段大小比较或DNA条形码比对的标准栽培茄、水茄、喀西茄或

蒜芥茄种质：赣茄1号、改良托鲁巴姆、HC002和HC003（附录4）。

2.3

DNA条形码DNAbarcode

DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA

片段，DNA条形码技术可用于鉴定物种及物种间亲缘关系。

matK：植物叶绿体中赖氨酸tRNA内含子内的成熟酶（参与RNA转录本中II型内含子剪切）编码

基因。

psbA-trnH：植物叶绿体psbA基因和trnH基因间的间隔序列。

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3方法原理

根据茄属种质的matK或psbA-trnH序列特征，应用DNA条形码技术对茄属种质栽培茄、水茄、

喀西茄或蒜芥茄进行鉴定。

4仪器设备与主要试剂耗材

仪器设备及试剂、耗材参见附录A。

5溶液配制

溶液配制方法参见附录B。

6DNA条形码引物

DNA条形码引物相关信息见附录C。

7DNA条形码序列

DNA条形码序列相关信息见附录D。

8参照种质

参照种质参见附录E。

在进行等位变异检测时，应同时包括相应参照材料。

9DNA条形码序列的获取

9.1样品准备

取0.2~0.5g待测种质或参照种质的植物组织置于2ml离心管中，做好标记。

9.2DNA提取

9.2.1待测种质和参照种质采用改良CTAB法提取DNA，步骤如下：

a）取直径为6mm钢珠2粒放入装有样品的2ml离心管中，加入预热至65℃的CTAB溶液800μL，

于植物组织研磨仪中充分研磨后，65℃水浴20min。

b）取出离心管加入600μL氯仿/异戊醇（24：1）溶液后，上下颠倒混匀，10,000rpm离心10min。

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c）取上清液400μL于新的1.5ml离心管，加入800μL无水乙醇并混匀，10,000rpm离心10min。

d）去上清液，加入75%无水乙醇，颠倒混匀后于10,000rpm离心2min，弃上清，自然晾干后加

50μLddH2O溶解DNA。

e）用超微量分光光度计检测DNA浓度，用ddH2O将DNA稀释到100ng/μL，置于-20℃冰箱保存

备用。

9.2.2若待测种质样本量少，或样本已降解或部分降解，可购买专用试剂盒提取DNA，按照试剂盒的说明进行提取，并按照9.2.1步骤e）的方法存放。

9.3PCR扩增

9.3.1PCR反应体系

PCR反应体系为：2×TaqMasterMix（含染料）20μL，10μM正向引物（附录C表C.1）和反向引物（附录C表C.1）各0.4μL，100ng/μL的DNA模板2.0μL，ddH2O补齐至40μL。每管PCR体系

滴入一滴液体石蜡防止蒸发。

9.3.2PCR反应程序

所述PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，38个

循环；72℃延伸5min。

9.4PCR扩增产物检测

9.4.1凝胶制备

称取1.2g琼脂糖于三角瓶中，加入120ml1×TAE缓冲液，在微波炉中加热至完全溶解后自然冷却至约50℃,加入12μL核酸凝胶染色试剂GelRed（10,000×水溶液），混匀后倒于放有凝胶托盘的制胶

盒中，垂直将加样梳插入制胶盒的小凹槽中。

9.4.2电泳及检测

琼脂糖胶凝固后，垂直拨出加样梳，将凝胶托盘取出置于电泳槽中，用移液器吸取5μLDL2000Marker点于每排第一个加样孔，其后依次加入4μL