免疫细胞的分离与检测.pptVIP

EAC-花环：B淋巴细胞表面有补体受体，在抗体致敏的红细胞中加入补体，可形成红细胞-抗体-补体复合物，再与B淋巴细胞混合，则可形成EAC玫瑰花环。第三节免疫细胞功能测定转化、增殖试验细胞毒试验抗体形成试验细胞吞噬与杀伤试验一、转化、增殖试验淋巴细胞转化试验：刺激物分为非特异性（如植物血凝素、刀豆素A等）和特异性刺激因子（如抗原）；检测方法为形态学检测法和3H-TdR掺入法及MTT法等。混合淋巴细胞培养：混合淋巴细胞培养(MLC)或称混合淋巴细胞反应(MLR)常用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA抗原)相容的程度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进NK、LAK和CTL等杀伤细胞的分化，因此又是免疫调节研究中常用的实验模型。丝裂原（抗原）刺激小淋巴细胞在转化为原始母细胞过程中，合成DNA增加，能够吸收胸腺嘧啶核苷（3H）3H-TdR放射性测定淋巴细胞转化试验原理示意第三节免疫细胞功能测定ADCC作用测定T细胞介导的细胞毒试验NK活性测定二、细胞毒检测试验效应细胞分离上清细胞毒试验原理示意放射性测定靶细胞2、K细胞活性测定（ADCC活性测定）动物机体有些免疫细胞，通过抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）杀伤靶细胞，如NK细胞、活化的T细胞、吞噬细胞等，这类细胞统称为K细胞。K细胞的活性不仅反映机体细胞免疫的能力，而且与体液免疫也有直接的关系。K细胞活性检测的方法有同位素释放试验法，溶血空斑法，细胞剥离法和靶细胞接合试验。仅介绍同位素释放法。（2）方法试验管：效应细胞(淋巴细胞悬液)，标记的靶细胞(Cr51标记的鸡红细胞)和亚凝集单位的抗体(兔抗鸡红细胞抗体)各0.1ml，加RPMI1640完全培养基1.7ml（ADCC）。效应细胞对照管：效应细胞和标记的靶细胞各0.1ml加上述完全培养基1.8ml（未加抗体）。抗体对照管：标记的靶细胞和亚凝集单位的抗体各0.1ml，加完全培养基1.8ml（未加效应细胞）。最大释放对照管：标记的靶细胞0.1ml加蒸馏水1.9ml（靶细胞会裂解，完全释放同位素）。自然释放管：标记的靶细胞0.1ml，加完全培养基1.9ml（靶细胞不裂解，但可自然释放一定量的同位素）。以上各管均置37℃5～20h后，2500g离心10min，分别取各管上清夜1.0ml置于5支试管中，用γ计数仪测各管上清和沉淀中的cpm值。（3）结果判断和计算12×(上清cpm—本底cpm)×100%(上清cpm-本底cpm)＋(沉淀cpm-本底cpm)51Cr实验释放率（%）试验释放率—自然释放率×100%最大释放率－自然释放率51Cr特异释放率（%）23、NK细胞活性测定NK细胞是具有天然杀伤靶细胞活性的淋巴样细胞，其杀伤作用不需要抗体、补体的参加，所杀伤靶细胞通常指肿瘤细胞和病毒感染或转化的细胞。这样，可以将来源于同种动物的肿瘤细胞系或病毒转化的细胞系，作为检测NK细胞活性的指示细胞。01NK细胞活性测定多采用51Cr释放法试验，其原理同细胞毒性T细胞试验中所采用的51Cr释放法试验。在这里以检测小鼠脾脏NK细胞活性为例，说明本试验方法。用3H-TdR掺入法，靶细胞为YAC-1细胞株（小鼠淋巴瘤细胞系）。02试剂小鼠脾细胞悬液:分离单个脾脏细胞---裂解红细胞---淋巴细胞洗涤配置悬液（1640完全培养基2×106/ml）。标记的靶细胞：活淋巴细胞（96%以上）加入H3-Tdr---孵育2小时/每30min振摇---洗3次---配成2×106/ml悬液。010203直接溶血空斑试验间接溶血空斑试验SPA-SRBC溶血空斑试验三、抗体形成试验细胞吞噬与杀伤功能试验细胞吞噬功能试验细胞杀菌功能试验吞噬百分率=吞有颗粒的吞噬细胞数计数的吞噬细胞数吞噬指数=吞噬细胞吞噬的总颗粒数计数的吞噬细胞数原理：01N-N-C+H+N=N-R-02NH2CN=NH03四氮唑基（淡黄色）04甲月簪基（紫黑色）05NBT还原试验方法：01抗凝血+硝基蓝四氮唑（NBT），37。C孵育25min。推片染色、镜检。02正常值：03NBT阳性细胞7.5-15%04NBT还原试验第四节免疫细胞凋亡测定01细胞凋亡的概念与原理02细胞凋亡的检测方法一、免疫细胞的特征1、免疫细胞的形态学特征理化性状