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CEX-HPLC各峰差异分析

华中科技大学（糖型+脱酰胺）

2015-04-16

样品信息

供试品名称：重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体注射液

供试品批号：CEXpeak1/CEXpeak2/CEXpeak3/CEXpeak4/CEXpeak5

试验方法

1)蛋白质供试品脱糖反应

取100μg供试品于加水稀释至100μL，Denaturebuffer加热变性后加入G7buffer，NP40buffer，PNGaseF酶（nova），37℃过夜。PGCSPE柱纯化后真空干燥，-20℃保存。

2)糖基2-AA荧光标记

称取适量2-AA、2-PB，溶于100μlDMSO/AceticAcid混合液，混匀。取20μl反应液到干燥后的糖基中，混匀。水浴65℃孵育2h。MCCSPE柱纯化后真空干燥，-20℃保存。

3)HILIC糖基分离

采用岛津HPLC液相系统LC-20AD进行分离。液相A液为Ph4.4，50mM甲酸铵水溶液，B液为100%乙腈。色谱柱为TSKgelAmide-804.6mm*25cm5μm。2-AA标记后的糖基由自动进样器上样到色谱柱，以68%B液平衡30min，流速为1ml/min。再以如下液相梯度洗脱：0分钟---40分钟，B液梯度68%，4分钟---60分钟，B液线性梯度从68%到53%，60分钟---61分钟，B液线性梯度从53%到0%，61分钟---65分钟，B液线性梯度从0%到68%10%，65分钟---75分钟，B液线性梯度维持68%。检测器为RF-20A荧光检测器，激发波长:360nm，接收波长:419nm。

4)质谱鉴定

2-AA标记后糖基产物经nanoLC-TripleTOF5600质谱仪进行质谱分析。分析时长：24min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：400-2000m/z，一级质谱分辨率：30,000。

5)数据处理

用LCsolution软件（岛津）对糖基荧光色谱图中主要色谱峰进行积分分析获得糖基保留时间和色谱峰面积。分析相应保留时间的糖基分子的一级质谱图得到其分子量，通过GlycoWorkbench2查询ConsortiumforFunctionalics(CFG)数据库及自制数据库，获得相关糖型信息。

结果

a)HILIC荧光色谱

100μg供试品脱糖后糖基经2-AA标记后复溶于100μl去离子水，取10μl样品经HILIC

色谱柱分离，所得图谱见图1-1至图1-5，相关色谱峰保留时间表见表1。积分计算色谱峰峰面积以及其相对含量（面积%）见表2。5批次供试品色谱比较图见图2。

色谱峰保留时间表

Peak#

Glycan

Ret.TimeCEXpeak1

Ret.TimeCEXpeak2

Ret.TimeCEXpeak3

Ret.TimeCEXpeak4

Ret.TimeCEXpeak5

Average

RSD

0

17.064

16.981

17.023

0.24%

1

19.319

19.306

19.255

19.253

19.233

19.273

0.17%

2

G0F

21.986

21.957

21.932

21.934

21.915

21.945

0.11%

3

24.190

24.202

24.087

24.089

24.096

24.133

0.21%

4

G1F

26.588

26.556

26.532

27.198

27.195

26.814

1.17%

5

30.322

30.293

30.250

30.254

30.280

0.10%

6

G2F

31.832

31.841

31.838

31.841

31.783

31.827

0.07%

7

G2FS1

34.463

34.441

34.412

34.434

34.389

34.428

0.07%

8

G2FS2

37.262

37.223

37.138

37.057

37.131

37.162

0.20%

9

39.562

39.529

39.506

39.532

0.06%

Peak#

Glycan

Area%CEXpeak1

Area%

CEXpeak2

Area%

CEXpeak3

Area%CEXpeak4

Area%CEXpeak5

Average

RSD

0

0.852

1.593

1.223

30.31%

1

3.736

4.108

5.880

9.871

17.671

8.253

62.8