克隆基因的表达及基因干扰.ppt

2靶蛋白与第一抗体反应3与第二抗体反应1封闭4显色靶蛋白的免疫学检测四、表达产物的鉴定表达产物的鉴定表达产物的鉴定第三节基因表达干扰技术核酶与脱氧核酶微RNA反义核酸技术小干扰RNA第三节基因表达干扰技术反义RNA技术01反义核酸技术的应用02反义寡核苷酸技术03一、反义核酸技术5%55%30%10%反义寡核苷酸的作用机制反义寡核苷酸的修饰反义寡核苷酸的设计与合成反义寡核苷酸的给药途径（一）反义寡核苷酸技术一、反义核酸技术反义寡核苷酸技术反义寡核苷酸的作用机制01抑制mRNA的翻译02抑制复制或转录03抑制蛋白质的加工、修饰及功能表达04一、反义核酸技术反义寡核苷酸的设计与合成设计计算机软件预测RNA的二级结构利用寡核苷酸随机文库鉴别mRNA上的RNaseH切割位点、寡核苷酸芯片的扫描分析、随机寡核苷酸库结合逆转录分析法等对自然折叠的mRNA进行设计一、反义核酸技术长度一般为15～25个核苷酸01G-C含量为60%～65%02合成一、反义核酸技术最常见的是对ASON的骨架中的磷酸基团进行修饰0101020304硫原子代替磷酸二酯中的氧原子甲基修饰磷酸骨架聚酰胺键代替磷酸骨架020304反义寡核苷酸的修饰一、反义核酸技术直接作用于培养细胞010203结合L-多聚赖氨酸或脂质体进入细胞动物模型则可通过静脉、腹腔、皮下、肌肉、瘤体内注射或气雾吸入等途径反义寡核苷酸的给药途径一、反义核酸技术反义RNA的作用机制01反义RNA的设计02（二）反义RNA技术一、反义核酸技术抑制DNA复制阻止目的mRNA的成熟及向胞浆内转运抑制mRNA翻译使mRNA更易被核酸酶识别而降解反义RNA技术反义RNA的作用机制一、反义核酸技术一、反义核酸技术反义RNA的设计与ASON相比，反义RNA的设计较为简单一、反义核酸技术（三）反义核酸技术的应用需要完善或解决的问题：①防止被核酸酶降解②需要进一步了解寡核苷酸进入细胞的确切机制③很多寡核苷酸易发生序列特异性和非序列特异性的结合④ASON是否会影响正常细胞的基因表达⑤用载体导入反义RNA在体内表达时，存在安全性和转染效率不高等问题01核酶02脱氧核酶二、核酶与脱氧核酶0102030405核酶的设计与修饰核酶的结构核酶转移方法核酶的分类核酶的应用（一）核酶二、核酶与脱氧核酶核酶的分类核酶第Ⅰ类内含子、第Ⅱ类内含子、核糖核酸酶P大分子核酶：锤头状RNA、发夹形RNA、肝炎D病毒RNA和neurosporaVarkudsatellite核酶小分子核酶：二、核酶与脱氧核酶二、核酶与脱氧核酶核酶的结构锤头状核酶：二级结构有三个螺旋环结构区和一个催化中心二、核酶与脱氧核酶发夹形核酶：每个结构域由螺旋-环-螺旋组成5%55%30%10%脱氧核酶的结构种类及特征设计合成脱氧核酶的原则脱氧核酶的催化特性脱氧核酶的应用（二）脱氧核酶二、核酶与脱氧核酶二、核酶与脱氧核酶脱氧核酶脱氧核酶的结构种类及特征10-23型脱氧核酶：二、核酶与脱氧核酶8-17型脱氧核酶：第七章克隆基因的表达及基因干扰

上海交通大学倪培华第七章克隆基因的表达及基因干扰

第一节外源基因的表达第二节表达产物的分离、纯化与鉴定第三节基因表达干扰技术第一节外源基因的表达01真核生物表达体系02原核生物表达体系第一节外源基因的表达原核生物表达体系原核表达载体具有的特点包涵体对外源目的基因的要求真核生物基因在原核细胞中的表达一、原核生物表达体系对外源目的基因的要求不应具有5′端非编码区以及内含子结构选择标志启动子翻译起始点和终止序列多克隆位点（二）原核表达载体具有的特点一、原核生物表达体系融合型表达蛋白A分泌型表达蛋白B非融合型表达蛋白真核生物基因在原核细胞中的表达C一、原核生物表达体系非融合型表达蛋白优点：表达的非融合蛋白与天然状态下存在的蛋白在结构、功能以及免疫原性等方面基本一致缺点：易被细菌蛋白酶破坏真核生物基因在原核细胞中的表达12一、原核生物表达体系一、原核生物表达体系常用的非融合型表达蛋白表达原核载体pKK223-3抗氨苄青霉素基因Tac启动子SD序列AUG起始密码转录终