A型塞尼卡病毒与O型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒鉴别检测 多重RT-PCR和多重qRT-PCR法.docxVIP

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A型塞尼卡病毒与O型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒鉴别检测多重

RT-PCR和多重qRT-PCR法

1范围

本文件规定了用于A型塞尼卡病毒与O型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒的鉴别检测的多重RT-PCR和qRT-PCR方法，包括试剂、主要仪器设备、操作步骤及结果判定等技术要求。

本文件适用于A型塞尼卡病毒与O型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒鉴别检测诊断。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T18935-2018口蹄疫诊断技术

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

SN/T1193基因检验实验室技术要求

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

SVA：A型塞尼卡病毒（SenecavirusA）

FMDV：口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus）

RT-PCR:反转录聚合酶链反应（Reversetranscriptionpolymerasechainreaction）qRT-PCR:实时荧光定量反转录聚合酶链反应（Real-timeRT-PCR）

Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数（Cyclethreshold）

4试剂

4.1引物探针

引物序列见附录A，上游、下游引物的使用浓度均为25pmol/μL。

4.2RNA提取试剂盒

宜选取商品化的病毒RNA提取试剂试剂盒。

4.3PCR和qRT-PCR扩增试剂

应按照不同的PCR和实时荧光PCR平台的说明书选取推荐的PCR和qRT-PCR扩增试剂。

4.4其他试剂

宜选取商品化的反转录试剂盒、胶回收试剂盒、T4连接酶试剂盒、质粒提取试剂盒和电泳缓冲液。

5主要仪器设备

生物安全柜、普通PCR仪、荧光PCR仪、高速台式冷冻离心机、电热恒温水槽、混匀器、组织匀浆机、凝胶成像系统、微量移液器。

6操作步骤

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6.1操作环境

有相应的生物安全设施和不同功能分区，如样品处理区、核酸提取区、样品配液区、PCR扩增区、结果观察区等，各功能区须有专用试剂和实验耗材，不可交叉混用。操作时，应在生物安全Ⅱ级及以上防护实验室内、无RNA酶的环境下进行。

6.2待检样品处理

无菌采取发病猪淋巴结、水疱皮、痂皮等约1g样品，置于2.0mLEP管中，加入灭菌的1mol/LPBS（pH7.2）1mL，用组织匀浆机或研钵充分研磨后，反复冻融3次；以10000×g离心5min，收集上清，用于RNA抽提，或置-20℃保存备用。

6.3待检样品RNA/DNA提取

取200μL待检样品于无RNA/DNA酶的1.5mL离心管中，按照RNA/DNA提取试剂盒操作说明书抽提RNA/DNA。

6.4反转录(RT)

提取样品总RNA后，以样品总RNA为模板，按下列反应体系进行反转录：

5×RT缓冲液4μL

AMV反转录酶（5U/μL）0.5μL

dNTP混合物（各10mM/L）1μL

RNA酶抑制剂（40U/μL）0.5μL

随机引物6聚体（50pmol/μL）1.5μL

待检总RNA模板5μL

灭菌双蒸水补足总体积至50μL

加完试剂后瞬时离心混匀。将PCR反应管置于普通RT-PCR仪内进行反转录。反应程序为：30℃,10min；48℃,45min；95℃,5min。获得的cDNA直接用于多重PCR扩增，或置-20℃保存备用。

6.5多重PCR扩增

6.5.1反应体系的配置

反转录后，以获得的cDNA为模板,建立25μLPCR反