基因工程的常规技术.ppt

PCR技术的基本原理无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。12PCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火PolymeraseChainReaction(PCR)A序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。B引物长度以15-30bp为宜（171.5×1010bp）。C碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。D引物内部避免形成二级结构。E两引物间避免有互补序列。F引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。引物设计：聚偏氟乙烯(PVDF)、十二烷基磺酸钠(Sodiumdodecylsulfate,SDS),第三节基因工程的常规技术杂交技术PCR技术凝胶电泳技术基因文库构建一凝胶电泳技术凝胶电泳：用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等作为介质的区带电泳法称为凝胶电泳技术。凝胶电泳的原理：分离原理-在电场的作用下，DNA分子在琼脂糖凝胶中移动时，有电荷效应和分子筛效应。检测原理-溴化乙锭（EB）在紫外光照射下能发射荧光，当用EB对DNA样品染色时，加入的EB就插入DNA分子中，荧光强度与DNA含量成正比。影响琼脂糖凝胶电泳的因素：DNA片段的大小凝胶的类型凝胶的浓度电泳缓冲液电压琼脂糖凝胶电泳装置：琼脂糖凝胶电泳装置：凝胶成像分析系统：DNA电泳图谱RNA电泳图谱重组子：2.7kb+4.0kb非重组子：2.7kbpUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’ori4.0kb2.7kb5.4kbL1L24.0kbPH聚丙烯酰胺凝胶电泳装置及其原理示意图SDS电泳图谱1975，EdwenSouthern提出分子印迹概念。概念：将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于固定化介质上并加以检测分析的技术。目前主要应用于DNA，RNA，蛋白质的检测。二杂交技术核酸分子杂交的基本原理：具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。0102DNA-DNA杂交双链分子Southernblotting基因组DNA经限制性内切酶消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA片断的凝胶放入变性溶液变性后，将硝酸纤维膜(NC)膜放在胶上，上面放吸水纸巾，利用毛吸作用使胶DNA转移质NC膜上，然后利用杂交技术检测NC膜上的DNA片断。DNA印迹技术SouthernBlotting:GelTransferSouthernblotNorthernblotting1与Southernblotting相似，但不需要限制性内切酶切割。用于基因表达的特异性分析和定量分析。2RNA印迹技术酵母转化子Northern杂交结果免疫印迹法是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白质的定性方法，也可以作为确定同一蛋白质在不同细胞或者同一种细胞不同条件下的相对含量的半定量方法。由于其检测往往需要抗体，所以也被称为免疫印迹技术。Westernblotting:检测样品中特异蛋白存在与否细胞中特异蛋白的半定量分析蛋白质分子相互作用的研究应用蛋白质免疫印迹法原理：蛋白质组分经SDS分离后，平行转移到固相支持体（NC膜或PVDF膜）上，通过免疫试剂来检测靶蛋白。靶蛋白的检测通常采用两步法或间接法，用一抗结合靶蛋白，再用过氧化物酶（HRP）标记的二抗结合一抗，然后HRP催化化学显色反应或化学发光反应。三PCR技术KaryB.Mullis（穆利斯（美））PCR技术的创建01040203Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。KaryB.Mullis（1944－