免疫组化和荧光.ppt

2014-3-21*制作者：白慧2014-3-21*免疫组化图片2014-3-21*免疫荧光图片2014-3-21*免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素等)显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法；这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。免疫组化与免疫荧光2014-3-21*实验原理免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记的显色剂显色来确定组织细胞内抗原；免疫荧光技术是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。2014-3-21*实验步骤脱蜡水化：二甲苯Ⅰ20min二甲苯Ⅱ20min无水乙醇Ⅰ10min无水乙醇Ⅱ10min95%乙醇5min80%乙醇5min75%乙醇5min50%乙醇过一遍蒸馏水过三遍高压修复4min流水冷却PBS冲洗5min×3次3%H2O215min，37℃/(0.5%Triton5min)PBS冲洗5min×3次10%山羊血清封闭37℃，50min一抗4℃,过夜复温37℃，1h

PBS冲洗5minx3次

二抗30min

PBS冲洗5minx3次

DAB显色＜1min/(DAPI5min)

PBS冲洗(盖片，观察。)苏木素复染1min自来水冲洗脱水，透明，封片。2014-3-21*2014-3-21*注意事项标本固定脱水、石蜡包埋和制片脱蜡和水化抗原修复细胞通透灭活内源性过氧化物酶和生物素血清封闭一抗和二抗浓度和孵育时间抗体稀释液切片清洗DAB显色避光复染封片①防止标本从玻片上脱落；②除去妨碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存。固定剂的选择一般用4%多聚甲醛脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用TritonX-100、蛋白酶k等通透液。如TritonX-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。灭活内源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右，而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min；过氧化氢孵育时间过长易引起脱片组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；但不能与一抗来源一致。一般室温10-30min。一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间、温度和抗体浓度。一抗孵育温度有：4℃、室温、37℃，其中4℃效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37℃1-2h，而4℃过夜和从冰箱拿出后37℃复温45min较好。二抗一般室温或37℃30min-1h。抗体稀释液用一般PBS即可，但专用的抗体稀释液中除PBS外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，对抗体的多次回