食品中氨基酸的测定.docx

食品中氨基酸的测定

食品中氨基酸的测定依据GB5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》。本标准规定了用氨基酸分析仪(茚三酮柱后衍生离子交换色谱仪)测定食品中氨基酸的方法。

本标准适用于食品中酸水解氨基酸的测定,包括天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸共16种氨基酸。

1.原理

食品中的蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过可见光分光光度检测器测定氨基酸含量。

2.仪器

氨基酸分析仪：茚三酮柱后衍生离子交换色谱仪。

3.试剂

（1）柠檬酸钠缓冲溶液［c（Na+）=0.2mol/L］：称取19.6g柠檬酸钠加入500mL水溶解，加入16.5mL盐酸，用水稀释至1000mL，混匀，用6mol/L盐酸溶液或500g/L氢氧化钠溶液调节pH至2.2。

（2）混合氨基酸标准储备液（1μmol/mL）：分别准确称取单个氨基酸标准品（精确至0.00001g）于同一50mL烧杯中，用8.3mL6mol/L盐酸溶液溶解，精确转移至250mL容量瓶中，用水稀释定容至刻度，混匀。

（3）混合氨基酸标准工作液（100nmol/mL）：准确吸取混合氨基酸标准储备液1.0mL于10mL容量瓶中，加pH2.2柠檬酸钠缓冲溶液定容至刻度，混匀，为标准上机液。

4.分析步骤

（1）试样准备固体或半固体试样使用组织粉碎机或研磨机粉碎，液体试样用匀浆机打成匀浆密封冷冻保存，分析用时将其解冻后使用。

（2）试样称量均匀性好的样品，如奶粉等，准确称取一定量试样（精确至0.0001g），使试样中蛋白质含量在10～20mg范围内。对于蛋白质含量未知的样品，可先测定样品中蛋白质含量。将称量好的样品置于水解管中。

很难获得高均匀性的试样，如鲜肉等，为减少误差可适当增大称样量，测定前再做稀释。

对于蛋白质含量低的样品，如蔬菜、水果、饮料和淀粉类食品等，固体或半固体试样称样量不大于2g，液体试样称样量不大于5g。

（3）试样水解根据试样的蛋白质含量，在水解管内加10～15mL6mol/L盐酸溶液。对于含水量高、蛋白质含量低的试样，如饮料、水果、蔬菜等，可先加入约相同体积的盐酸混匀后，再用6mol/L盐酸溶液补充至大约10mL。继续向水解管内加入苯酚3～4滴。

将水解管放入冷冻剂中，冷冻3～5min，接到真空泵的抽气管上，抽真空（接近0Pa），然后充入氮气，重复抽真空-充入氮气3次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖。

将已封口的水解管放在110℃±1℃的电热鼓风恒温箱或水解炉内，水解22h后，取出，冷却至室温。

打开水解管，将水解液过滤至50mL容量瓶内，用少量水多次冲洗水解管，水洗液移入同一50mL容量瓶内，最后用水定容至刻度，振荡混匀。

准确吸取1.0mL滤液移入到15mL或25mL试管内，用试管浓缩仪或平行蒸发仪在40～50℃加热环境下减压干燥，干燥后残留物用1～2mL水溶解，再减压干燥，最后蒸干。

用1.0～2.0mLpH2.2柠檬酸钠缓冲溶液加入到干燥后试管内溶解，振荡混匀后，吸取溶液通过0.22μm滤膜后，转移至仪器进样瓶，为样品测定液，供仪器测定用。

5.测定

（1）仪器条件：使用混合氨基酸标准工作液注入氨基酸自动分析仪，参照JJG1064—2011氨基酸分析仪检定规程及仪器说明书，适当调整仪器操作程序及参数和洗脱用缓冲溶液试剂配比，确认仪器操作条件。

（2）色谱参考条件

①色谱柱：磺酸型阳离子树脂；

②检测波长：570nm和440nm。

（3）试样的测定混合氨基酸标准工作液和样品测定液分别以相同体积注入氨基酸分析仪，以外标法通过峰面积计算样品测定液中氨基酸的浓度。

6.计算

（1）混合氨基酸标准储备液中各氨基酸浓度的计算

混合氨基酸标准储备液中各氨基酸的含量按下式计算：

式中

cj——混合氨基酸标准储备液中氨基酸j的浓度，μmol/mL；

mj——称取氨基酸标准品j的质量，mg；

Mj——氨基酸标准品j的分子量；

250——定容体积，mL；

1000——换算系数。

结果保留四位有效数字。

（2）样品中氨基酸含量的计算

样品测定液氨基酸的含量按下式计算

式中

ci——样品测定液氨基酸i的含量，nmol/mL；

Ai——试样测定液氨基酸i的峰面积；

As——氨基酸标准工作液氨基酸s的峰面积；

cs——氨基酸标准工作液氨基酸s的含量，nmol/mL。

试样中各氨基酸的含量按下式计算：

式中

Xi——试样中氨基酸i的含量，g/100g；

ci——试样测定液中氨基酸i的含量，nmol/mL；

F——稀释倍数；

V——试