外源基因表达与基因工程药物.pptVIP

常用的载体有：

质粒（plasmid）－是存在于细菌染色体外的、能自主复制的环状双链小分子DNA，适于做小片断基因的载体。噬菌体DNA－线状双链DNA，适于做大片断基因的载体。大肠杆菌的质粒载体氨苄青霉素抗性基因：ampr；四环素抗性基因：tetr；DNA复制起点：ori用质粒构建重组DNA分子返回组成特点：λ噬菌体双链线状DNA分子，全长50kb，含65个基因，在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点。用噬菌体DNA构建重组DNA分子㈠克隆载体以扩增DNA片断为目的，并不需要得到目的基因所编码蛋白质的载体，适用于外源基因的重组、克隆、复制与保存；克隆载体常带有一个松弛型复制子，一个多克隆位点、筛选标记分类：质粒、噬菌体、黏性质粒、M13噬菌体、酵母载体、真核细胞病毒载体1.常用的克隆载体质粒和噬菌体常用于原核细胞为宿主的分子克隆，病毒则使用于真核细胞为宿主的克隆（二）表达载体能使外源基因在宿主细胞中转录和表达的功能性载体。itemClicktoedittextClicktoedittext1.很强启动子，能被宿主RNA聚合酶识别2.很强终止子3.启动子只有在诱导状态时才能启动转录4.起始密码和SD序列处在合适距离5.需复制原点，在载体内插入人工组成的多克隆位点具备条件能接纳重组子并实现重组子的外源基因转录、扩增或表达的受体细胞。1原核细胞：大肠埃希菌、芽胞杆菌等。属于原核细胞表达系统。2真核细胞：酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞。属于真核细胞表达系统。3宿主（host）1972年，美国斯坦福大学Berg博士领导的一个研究小组，率先完成了世界上第一次成功的DNA体外重组实验，基因工程从此诞生。目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线筛选获得了重组DNA分子的受体细胞进行克隆----分子克隆。从生物有机体的基因组中，分离出带目的基因的DNA片段------目的基因的获得。将重组DNA分子转移到适当的受体细胞内------导入。将带目的基因的外源DNA片段，连接到能自我复制的载体分子上，形成重组DNA分子------DNA分子重组。克隆基因的表达，产生出人类所需要的物质----基因表达。基因工程的主要步骤目的基因制备和常用分离方法目的基因：指已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段。通常是人们需要的生物活性物质的编码基因。12目的基因的获得1.人工化学合成概述：1979年采用化学方法合成基因；只要合成出具有特定序列的寡核苷酸片断，通过DNA连接酶的作用，可使其按照一定的顺序进行共价连接而成PCR扩增技术聚合酶链式反应，体外扩增特定基因序列的方法。是有引物介导的特定DNA序列的酶扩增，能将pg水平的DNA特异扩增100万倍(ug)。据碱基配对原理，在DNA聚合酶催化和dNTP的参与下，引物依赖于DNA模板特异性引导DNA合成；包括变性、退火、延伸三步组成的循环。PCR基本原理“Idomybestthinkingwhiledriving”1993Nobelprize聚合酶链式反应:利用酶促反应在体外大量、特异性扩增DNA片段。把寻找目的基因和扩增目的基因两步操作并成一步。Annealing(退火):45～55℃Denaturation(变性):90～97℃Extension(延伸):around72℃threesteps:HowPCRworks医学上应用更为广泛，涉及各领域

正常人类生命活动的分子机制；

人类各种疾病发生的分子机理；

人类各种疾病如遗传性疾病、肿瘤、肥胖、心血管疾病、传染病等病因的查明、诊断、治疗和预防。

药物的研发和生产；

疾病模型的建立；

人类的营养、健康、长寿和保健（亚健康）DCBA现代科技革命高新技术生物技术（生物工程）基因工程E基因克隆本章节的地位：分子遗传学理论上的六大进展解决了生命现象的遗传物质基础（均是核酸）结构模型（同类构件、双螺旋）复制方式（相似的机制）遗传信息流动方向（共同的中心法则）遗传密码（共用一套相同的密码）表达和调控的机理（类同的方法）基因突变机理、意义（变异与进化）为基因工程技术的诞生典定了理论基础。理论上的可行性。科技探索之路：基础理论和技术发展催生了基因工程早期基础理论孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律科技探索之路：早期基础理论基础理论和技术发展催生了基因工程摩尔根