DB33T 2246-2020 猪流行性乙型脑炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法.docxVIP

ICS65.020.20B44

DB33

浙江省地方标准

DB33/T2246—2020

猪流行性乙型脑炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法

Real-timePCRdetectiontechniqueforJapaneseencephalitisvirus

2020-03-03发布2020-04-03实施

浙江省市场监督管理局发布

DB33/T2246—2020

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前言

本标准按照GB/T1.1-2009的规定编写。本标准由浙江省农业农村厅提出。

本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。本标准起草单位：浙江省动物疫病预防控制中心。

本标准主要起草人：谢荣辉、张传亮、吴赟竑、徐辉、刘霞、周蕾、柴娟、虞一聪、王雅婷、周彩琴、赵灵燕、刘爱军、吴雪军。

DB33/T2246—2020

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猪流行性乙型脑炎病毒荧光定量RT－PCR检测方法

1范围

本标准规定了猪流行性乙型脑炎病毒（Japaneseencephalitisvirus，JEV）荧光定量RT－PCR检测的实验条件、操作步骤和结果判定等要求。

本标准适用于猪流行性乙型脑炎病毒核酸的检测。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。2.1

猪流行性乙型脑炎

由猪流行性乙型脑炎病毒引起的一种急性传染病。猪的主要临床症状表现为高热、流产、死胎和公猪睾丸炎。

3实验条件

3.1仪器

3.1.1高速冷冻离心机。

3.1.2荧光定量PCR仪。

3.1.3生物安全柜。

3.1.4组织研磨仪。

3.1.5微量移液器。

3.1.6冰箱。

3.1.7涡旋混匀器。

3.1.8高压灭菌器。

3.2试剂

除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器分装。

3.2.1Trizol：核糖核酸（Ribonucleicacid,RNA）提取试剂。

3.2.2氯仿：4℃预冷。

3.2.3异丙醇：4℃预冷。

3.2.4焦炭酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate,DEPC）水：取DEPC100μL，加超纯水至100mL，室温过夜，121℃高压灭菌15min，分装，冻存备用。

3.2.575%乙醇：用75mL无水乙醇，加DEPC水至100mL，混匀，－20℃预冷。

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3.2.6商品化的一步法实时荧光RT-PCR反应试剂：OneStepPrimeScript?RT-PCRKit（PerfectRealTime，TAKARA)，含有2×OneStepRT-PCRBufferⅢ、ExTaqHS（5U/μL）、PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ和无RNA酶的水。

3.2.70.01mol/LPH7.4磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsaline,PBS）：取Na2HPO4.12H2O2.9g,KCl0.2g,KH2PO40.2g,NaCl8g,溶于800mL去离子水中，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将pH调节至7.4，然后加去离子水定容至1L，高温灭菌30min，室温保存。

3.2.8引物和探针，其序列如下：上游引物：5－GGCTCTTATCACGTTCTTCAAGTTT-3，下游引物：5-TGCTTTCCATCGGCCYAAAA-3，探针：5－FAM-AGCATTAGCCCCGACCAAGGCG-TAMRA-3。

3.2.9阳性对照：猪乙型脑炎活疫苗（SA14-14-2株）。

4操作步骤

4.1样品采集

4.1.1脑组织：选择代表性病症的病死猪，应无菌采集脑组织，将采集到的脑组织装入到无菌离心管中并编号，冷藏送检或-20℃以下保存备用。

4.1.2全血：用无菌注射器耳静脉采集猪血，将采集到的猪血装入到无菌离心管中并编号，冷藏送检。若不能及时送检的全血，应分离血清置于-20℃以下保存备用。

4.2样品处理

4.2.1取待检脑组织适量装入到无菌离心管中，按1：10体积加入PBS，置于组织研磨仪中充分研磨。将研磨后的样品，反复冻融3次，10000r/min离心5min，取上清液至无菌离心管中，编号待检。

4.2.2取全血3500r/min离心5min，取血清至无菌离心管中，编号待检。

4.3RNA提取

4.3.1按