第六章 酶分子工程概述课件.ppt

第六章酶分子工程概述酶既可在水溶液中发挥作用，也可在无水有机溶剂中发挥作用。但当与水混溶的有机溶剂加入蛋白质水溶液中时，则可看到酶失活。这是因为有机溶剂通过疏水相互作用直接结合于蛋白质，并改变溶液的介电常数。后者影响维持蛋白质天然构象的非共价力的平衡。因此，有机溶剂通过增加疏水核的溶解度，降低带电表面的溶解度而具有使蛋白质“从里往外翻”的倾向。另一方面，蛋白质（酶）要在几乎无水的环境中发挥作用，必须在其分子表面有一单层必需水来维持它的活性构象，而与水混溶的有机溶剂能夺去酶分子表面的必需水，因而使酶失活。第六章酶分子工程概述7.重金属离子和巯基试剂已知重金属阳离子，如Hg2+，Cd2+，Pb2+能与蛋白质的巯基反应（将其转化为硫醇盐），也能与组氨酸和色氨酸残基反应。此外，银或汞能催化水解二硫键巯基试剂通过还原二硫键也能使酶失活，但这个作用常是可逆的。第六章酶分子工程概述8.热热失活是最经常遇到的蛋白质失活工业上的酶法加工大多要求在较高温度下进行，因为这可以增加溶解度和反应速度以及降低溶液粘度、防止微生物污染。所以热失活是工业上最经常遇到的酶失活的原因。第六章酶分子工程概述热失活通常也是两步过程：酶可逆热伸展使它的反应基团和疏水区域暴露，随后相互作用导致不可逆失活。有两种构象过程能引起不可逆热失活。第一，由于热伸展，包埋的疏水区域一旦暴露于溶剂，则会发生蛋白质聚合。第二，单分子构象扰动能引起酶失活。高温下，酶丧失其常规的非共价相互作用，但当恢复常规条件时，在被扰动的酶分子结构中形成非天然的非共价相互作用，虽然这种结构从热力学上说不如天然构象稳定，但由于纯动力学原因还能保存下来，因为多肽链的分子运动随温度降低而下降。高温引起蛋白质一级结构的改变：高温（90-100℃）下，依赖pH的共价反应限制了酶的热稳定性。这些反应包括：Asn和Gln的脱胺作用，在Asp处的肽键水解，Cys的氧化，二硫交换作用和二硫键的破坏。上述这些破坏性反应直接导致高温下酶失活。此外，若系统中有还原糖（如葡萄糖），糖很易与Lys的ε-氨基作用，这叫“Maillard反应”，是食品工业中热失活的原因。第六章酶分子工程概述9.机械力压力、剪切力、振动超声第六章酶分子工程概述1).振动振动使蛋白质失活的机理是，振动增加气-液界面的面积。蛋白分子在这个界面上呈线性排列并伸展，以使疏水残基最大限度地暴露于空气。然后，蛋白质由于疏水区域的暴露而聚合。第六章酶分子工程概述2).剪切

当酶溶液快速通过管道或膜时，则在管（膜）壁处或靠近管（膜）壁处产生剪切力梯度。这个梯度能引起蛋白质构象变化，导致原先埋藏的疏水区域暴露，然后聚合。失活程度随剪切速度的增大和暴露时间的增长而增加。第六章酶分子工程概述3).超声波超声波压力使溶解的气体产生小气泡，小气泡迅速膨胀至一定程度时突然破碎，这就是空化作用，它既产生机械力，又产生化学变性剂（如在小气泡中热反应所产生的自由基），结果使蛋白质失活。第六章酶分子工程概述4).压力0.1-6×108pa的压力下可使酶失活。压力诱导的失活通常认为是蛋白质变性后聚合的结果，但还有另外两个失活机理：第一，已经证明，多亚基酶在高压下可解离成单体，取消压力后，活力得到不同程度的恢复，但很多这类失活是不可逆的。第二，关于乳酸脱氢酶的工作表明，半胱氨酸氧化与失活机理有关，而这个反应与压力引起的酶结构变化有关。第六章酶分子工程概述10.冷冻和脱水低温减弱疏水作用，引起蛋白质的解离和变性溶质（酶和盐）随着水分子的结晶而被浓缩，引起酶微环境中的pH和离子强度的剧烈改变。磷酸盐缓冲液的pH在冷冻后可由7变到3.5，离子强度提高，引起寡聚蛋白质的解离。第六章酶分子工程概述二硫交换或巯基氧化。酶浓度增加引起Cys浓度也增加。分子内和分子间的二硫交换反应就很容易发生，巯基在低温下更易氧化，因为在-3℃部分冻结系统内的氧浓度要比0℃溶液中的高1150倍。这种浓缩效应还能增加氧自由基的浓度。第六章酶分子工程概述11.辐射作用电离辐射：如γ射线，X射线，电子，α粒子等直接作用由于形成自由基而引起一级结构的共价改变，继而交联或氨基酸破坏。这导致天然构象丧失或聚合。间接作用是由于在水溶液中形成反应性产物，其中主要是·OH自由基，溶解的电子和H2O2等。第六章酶分子工程概述蛋白质失活既可由直接作用（辐射对蛋白质分子的影响）引起，也可由间接作用（水辐射分解副产物对蛋白质分子的影响）引起。第六章酶分子工程概述蛋白质稳定性的分子原因：A:金属离子、底物、辅助因子和其他相对分子质量配体的结合作用第六章酶分子工程概述金属离子由于结合到多肽链的