食品中蛋白质测定的其他方法.docx

蛋白质测定的其他方法

一、分光光度法

1.原理

食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3，5-二乙酰-2，6-二甲基-1，4-二氢化吡啶化合物。在波长400nm下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。

2.试剂

除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。

（1）氨氮标准储备溶液（以氮计）（1.0g/L）：称取105℃干燥2h的硫酸铵0.4720g，加水溶解后移于100mL容量瓶中，并稀释至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于1.0mg氮。

（2）氨氮标准使用溶液（0.1g/L）：用移液管吸取10.00mL氨氮标准储备液于100ml容量瓶内，加水定容至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于0.1mg氮。

3.仪器

分光光度计，电热恒温水浴锅，10mL具塞玻璃比色管。

4.分析步骤

（1）试样消解同凯氏定氮法。按同一方法做试剂空白试验。

（2）试样溶液的制备吸取2.00～5.00mL试样或试剂空白消化液于50mL或100mL容量瓶内，加1～2滴对硝基苯酚指示剂溶液，摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色，再滴加乙酸溶液至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。

（3）标准曲线的绘制吸取0.00mL、0.05mL、0.10mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL和1.00mL氨氮标准使用溶液（相当于0.00μg、5.00μg、10.0μg、20.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg和100.0μg氮），分别置于10mL比色管中。加4.0mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀。置于100℃水浴中加热15min。取出用水冷却至室温后，移入1cm比色杯内，以零管为参比，于波长400nm处测量吸光度值，根据标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程。

（4）试样测定吸取0.50～2.00mL（约相当于氮＜100μg）试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于10mL比色管中。以下按（3）自“加4mL乙酸钠-乙酸缓酸溶液（pH4.8）及4mL显色剂”起操作。试样吸光度值与标准曲线比较定量或代入线性回归方程求出含量。

5.计算

试样中蛋白质的含量按下式进行计算。

式中

X——试样中蛋白质的含量，g/100g；

c——试样测定液中氮的含量，μg；

c0——试剂空白测定液中氮的含量，μg；

V1——试样消化液定容体积，mL；

V2——制备试样溶液的消化液体积，mL；

V3——试样溶液总体积，mL；

V4——测定用试样溶液体积，mL

m——试样质量，g；

1000——换算系数；

100——换算系数；

F——氮换算为蛋白质的系数，一般食物为6.25；纯乳与纯乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、高粱为6.24；花生为5.46；大米为5.95；大豆及其粗加工制品为5.71；大豆蛋白制品为6.25；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30；复合配方食品为6.25。

二、杜马斯法（燃烧法）

1.原理

样品在900～1200℃高温下燃烧，燃烧过程中产生混合气体，其中的碳、硫等干扰气体和盐类被吸收管吸收，氮氧化物被全部还原为氮气，形成的氮气气流通过热导检测仪（TCD）进行检测。测得的氮含量转换成样品中的蛋白质含量。

2.仪器

氮/蛋白质分析仪。

3.分析步骤

按照仪器说明书要求准确称量0.1～1.0g样品（精确至0.0001g），用锡箔包裹后置于样品盘上。样品进入燃烧反应炉（900～1200℃）后，在高纯氧（≥99.99%）中充分燃烧。燃烧炉中的产物（NO2）被载气CO2送到还原炉中，经还原生产氮气后检测其含量。

4.计算

试样中蛋白质的含量按照下列公式进行计算（2-24）

式中X——试样中蛋白质的含量，g/100g；

c——试样中氮的质量分数，g/100g；

F——氮换算为蛋白质的系数。

5.说明

（1）燃烧法适用于所有种类的食品，它是凯氏定氮的一个替代方法。

（2）不需要任何有害化合物；可在3min内完成。最先进的自动化仪器可在无人看管状态下分析多达150个样品。

（3）燃烧法被列为我们国家测定蛋白质的标准方法，但所需仪器价格昂贵，并且非蛋白氮也包括在内。