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柴胡种子DNA分子鉴定规程

1范围

本文件规定了柴胡种子DNA分子鉴定的实时荧光PCR技术原理方法和操作规程。

本文件适用鉴定中药材南、北柴胡种子的真实性。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

实时荧光PCRReal-timePCR

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。

3.2

Ct值Cyclethreshold

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

4原理

基于实时荧光PCR技术，建立多重实时荧光PCR检测体系，采用DNA条形码中的ITS基因序列为靶基因，设计柴胡的通用引物与探针以及南柴胡和北柴胡的特异性引物和探针，通过对荧光聚合酶链式反应反应体系和反应条件的优化筛选，建立了多重实时荧光聚合酶链式反应方法，在同一聚合酶链式

反应反应体系中可以同时鉴别南、北柴胡种子的源性成分。

5仪器设备及试剂

2

5.1仪器设备

仪器设备见附录表A.1。

5.2试剂

5.2.1试剂见附录B.1。

5.2.2试剂的配制方法见附录B.2。

5.2.3除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的一级水。

6检测引物和探针

引物序列和探针，见表1

表1引物和探针序列

引物探针名称

序列(5-3)

扩增片段

(bp)

特征

BSF

CAGAATCCCGTGAACCATCG

135

南柴胡通用引物

BSR

TAAACCAGCCGCACGACG

BSP

JOE-CCTCCGCAGCTCGCTCGAAG-BHQ2

南柴胡特异探针

BCF

CGTCGTGCGGCTGGTTTA

113

北柴胡通用引物

BCR

TTGCTCACAGAGTAAACGGGCT

BCP

FAM-AAGAGAGTCACCGGAGATCGGAAAAC-BHQ1

北柴胡特异探针

BUF

AAACGACTCTCGGCAACG

145

柴胡属通用引物

BUR

CGTGCCCTCAGCCTAATG

BUP

ROX-CGTAGCGAAATGCGATACTTGGTG-BHQ2

柴胡属特异探针

7DNA提取

每份材料混合取0.3g（大约200粒），用灭菌后的研钵在液氮状态下研磨成粉末。将含有2%β-巯基乙醇的CTAB提取缓冲液置于65℃水浴锅中预热；将研磨好的样品取0.15g置于2.0mL的离心管中；加入700μL65℃预热的CTAB提取缓冲液，65℃保温30min，期间摇动3-4次；加入700μL氯仿/异戊醇（24:1），轻轻颠倒使其充分混匀，12000r/min离心10min，吸取上清液转移至另一个离心管中；将上清液转移到新的离心管中，加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，将其充分混匀，置于-20℃30min或过夜，12000r/min离心15min，收集沉淀；加入700μL70%无水乙醇漂洗，12000r/min离心2min，

弃掉上清液，此步骤重复一遍；室温下或超净工作台中自然风干DNA（不可太干）5-10min；加入50μL

3

的双蒸水或TE

缓冲液，涡旋振荡充分混匀，12000r/min离心2min，4℃保存备用或置于-20℃保存。也可用相关植

物提取试剂盒进行柴胡种子DNA的提取。

8核酸浓度及纯度测定

用Nanodrop紫外分光光度计对提取的DNA进行核酸浓度与纯度检测，OD260nm和OD280nm处测定其吸光值，OD260/280比值在1.7～1.9，说明提取种子DNA纯度为佳。DNA浓度控制在0.1～50ng/μL

之间，可作相应稀释以调整其浓度。

注：用于PCR反应的DNA溶液OD260/OD280比值一般不低于1.5，如低于1.5则重新进行DNA的提取。

9实时荧光PCR扩增

9.1反应体系

按照表2依次加入试剂，配制PCR反应体系，混匀离心分装至PCR反应管中，加入基因组DNA

模板，8000r/min离心1min，取出PCR管放入荧光定量PCR仪中。每个PCR反应设置3个平行。

表2