免疫学实验二ELISA(双抗夹心法).ppt

实验二、酶联免疫吸附试验实验内容：间接法－－－测乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA实验原理：酶联免疫吸附试验（ELISA）是将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术，可用于检测体液中微量的特异性抗体或抗原。首先，抗原、抗体的特异性反应在一种固相载体表面－聚苯乙烯微量反应板孔中进行，通过洗涤去除多余的游离反应物；然后加入酶标记的抗体或酶标记的抗抗体，从而形成抗体－抗原－酶标抗体复合物（双抗体夹心法）或抗原－抗体－抗抗体复合物（间接法）；此时加入酶底物和显色剂，在酶催化底物后，液体呈现显色反应。液体显色的强弱与复合物中待测抗原或抗体的量呈正比，借此可检测待测抗原或抗体的有无及含量。该技术的特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果容易观察。实验原理：免疫酶技术是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。其原理是酶与抗体或抗原结合后既不改变抗体或抗原的特异性及免疫反应性，也不影响酶的催化效能。当存在相应酶底物时，酶能催化产生有颜色的产物，颜色的有无及深浅能反映相应的抗原或抗体是否存在及其量的多少。添加标题添加标题添加标题添加标题添加标题双抗体夹心法：检测抗原最常用的方法间接法：检测抗体最常用的方法竞争法：既可检测抗原，亦可检测抗体生物素－亲和素系统ELISA法：是在ELISA中引入生物素或亲和素放大系统，检测极微量的抗原或抗体的方法。ELISA的测定方法包括：直接法间接法BAS-ELISA底物1.已知Ab包被固相2.加待检标本3.加生物素标记的特异性抗体4.加酶标记的亲和素5.加底物显色亲和素酶生物素待检标本biotin-avidin-system，生物素-亲和素系统此法敏感性更高。用于抗原抗体以及DNA、RNA的检测。材料和试剂：1.HBsAg、包被液。2.待检人血清。3.酶标记的抗HBsAb抗体。4.HBsAb阳性对照血清、HBsAb阴性对照血清5.洗涤液：PH7.40.01mol/LPBS-吐温20。6.底物溶液：OPD-H2O2或TMD-H2O2。7.终止液：2mol/LH2SO4。8.酶标反应板、移液器、恒温箱、酶标仪酶标板移液器酶标仪操作步骤：包被：将HBsAg用包被液作适当稀释（1：100），在96孔反应板中每孔加100μl，置37℃2h后再移置4℃过夜。添加标题洗涤：将96孔反应板倾去包被液，用洗涤液PBS-吐温20加满各孔，置3min,倾去，如此反复3次。（前两步已完成）添加标题已知抗原包被酶标板1弃去板内包被抗原2拍干3加满洗涤液（重复三次）3.加样阳性对照：第1、2孔加HBsAb阳性对照血清50μl；阴性对照：第3、4孔加HBsAb阴性对照血清50μl；空白对照：第5孔加生理盐水100μl；余下各孔加待检血清50μl。加酶标记的抗HBsAb抗体：除空白对照外各孔50μl，充分混匀。将即时帖覆盖于反应板上，37℃孵育30min。弃去反应孔内液体，拍干，用洗涤液注满各孔、静置30秒、再拍干，重复洗涤5次。(操作同2)显色：各孔（包括空白对照）加底物A液50μl（1滴），底物B液50μl（1滴），置37℃避光温育15min。终止反应：各孔加终止液50μl（2mol/LH2SO4）。比色：将反应板以酶标仪450nm处用空白孔调零，测各孔OD值。6.显色各孔（包括空白对照）加底物A液50μl（1滴），底物B液50μl（1滴），置37℃避光温育15min终止反应各孔加终止液50μl（2mol/LH2SO4）OPD（邻苯二胺）经酶作用后的显色反应终止前终止后TMB四甲基联苯胺经酶作用后的显色反应终止前终止后结果判断：计算：判断值＝阴性对照平均OD值×2.1结果判断：待测样品孔OD值大于或等于判断值为阳性；小于判断值为阴性。注：阴性对照OD值小于0.05按0.05计算，大于0.05按实际OD值计算判断值。注意事项：试剂及待测标本使用前应平衡至室温，并将试剂混匀，弃去1～2滴垂直滴加；严格按照操作程序依次加样，以保证实验结果准确性；应尽量避免孔中有气泡，以免所测得OD值不准确。思考题：免疫标记技术有哪些？各有何特点？。ELISA操作过程中应注意哪些问题？*