高效液相色谱课件.pptVIP

**************高效液相色谱仪的基本构造进样系统负责将样品注入流动相进入色谱柱。常见的进样器有手动注射器和自动进样器。流动相系统包括溶剂瓶、溶剂输送泵和混合装置,负责提供稳定的流动相流动。色谱柱填装有特定粒径和孔径的固定相填料,是整个分离过程的核心。检测器用于监测流出组分的物理化学性质变化,包括紫外检测器、荧光检测器等。色谱柱和填料材料色谱柱色谱柱是高效液相色谱的核心部件之一,决定了整个色谱过程的质量。不同材质和结构的色谱柱适用于不同的分离需求。填料材料色谱柱内填充的固定相材料是影响分离效果的关键因素。常见的有反相、正相、离子交换、凝胶渗滤等不同类型的填料。颗粒尺寸填料颗粒尺寸的大小会影响分离效率、压力和流速。通常使用3-5微米的微粒填料来实现更优秀的分离性能。孔径结构填料材料的孔径尺寸和分布对于目标物质的吸附和传质过程有重要影响,需要根据实际需求进行优化设计。溶剂组成和梯度洗脱1溶剂组成高效液相色谱通常使用水、甲醇或乙腈等极性溶剂作为流动相。合理选择溶剂种类和比例可以优化分离效果。2等度洗脱保持流动相组成不变,可以实现等度洗脱分离。这种方式简单易行,但分离能力有限。3梯度洗脱通过动态调整流动相组成,可以实现梯度洗脱。这种方式可以提高分离分辨率,但操作相对复杂。检测器原理和类型紫外-可见检测器检测对象吸收紫外或可见光的特性,能够灵敏检测有机化合物。适用于色谱分析中各类化合物的定性和定量测定。电化学检测器基于被分析物的氧化还原特性,通过电流或电势变化的测量来实现定量分析。具有灵敏度高、选择性强等优点。荧光检测器能够检测具有本征荧光或通过衍生化产生荧光的化合物。灵敏度高,适用于微量分析,广泛应用于药物、环境和生物样品检测。质谱检测器能够准确测定分子量和结构信息,为复杂样品分析提供强大支持,是高效液相色谱最常用的检测器之一。数据采集和分析软件主要功能通过专用软件采集色谱数据、执行定性和定量分析、绘制图形报告常用软件Empower、ChemStation、Chromeleon等数据处理功能峰值识别、积分、校正、数据拟合、标准曲线绘制报告生成自动生成分析报告,包括色谱图、峰值数据、定量结果等高效液相色谱分析需要专业的数据处理软件支持,以确保获得可靠准确的检测结果。选用适合实验需求的软件非常重要。样品前处理技术1样品采集从源头获取代表性样品2样品预处理去除干扰因素，提取目标物质3样品浓缩提高检测灵敏度，减少检测时间4样品稀释调节样品浓度，避免仪器过载有效的样品前处理是高效液相色谱分析的关键步骤。包括样品采集、预处理、浓缩和稀释等。通过这些步骤可以去除干扰物质，提高目标物的检测灵敏度和定量准确性。合理的样品前处理确保分析结果的可靠性和重复性。常见色谱模式介绍1反相色谱利用柱填料的亲和性对极性化合物进行分离，具有较高分离度和灵敏度。2离子交换色谱利用离子间相互作用实现离子性化合物的分离，适用于分析离子态样品。3凝胶过滤色谱根据分子量大小对化合物进行分离，可用于分离和分析高分子化合物。4亲和色谱利用生物分子间特异性相互作用分离目标化合物，适用于生物大分子分析。反相色谱法原理反相色谱法利用极性填料和非极性移动相,根据化合物的疏水性将其分离。具有强疏水性的化合物较快洗脱,而极性化合物滞留较长时间。特点反相色谱适用于广泛的化合物,可分离极性差异较大的化合物。操作简单,重现性好,为目前应用最广泛的色谱技术之一。离子交换色谱法1离子吸附原理离子交换色谱利用带电荷的离子与固定相上的离子基团之间的静电相互作用实现分离。2离子交换填料常见的离子交换填料包括阳离子交换树脂和阴离子交换树脂，根据分析物的电荷性质选择合适的填料。3溶剂的作用通过改变溶液的pH值、离子强度等条件可以调节分析物在填料上的保留程度，实现分离。4应用领域离子交换色谱法在离子类物质的分离分析中广泛应用，如无机离子、氨基酸、蛋白质等。亲和色谱法亲和分离过程亲和色谱利用生物分子间的高度特异性相互作用,如抗原-抗体、酶-底物等,实现目标物质的高选择性分离。亲和层析填料常见的亲和层析填料包括蛋白A/G、肝素、免疫亲和素等,能与目标分子特异性结合从而实现有效分离。亲和纯化过程亲和色谱通常包括结合、洗脱和再生三个步骤,可用于高效分离和纯化各类生物大分子。凝胶过滤色谱法原理根据分子量大小的不同，样品分子在凝胶填料中的运动速度不同，从而达到分离的目的。分离特点可以实现对复杂混合物的快速分离，对分子量有效区分，适用于蛋白质、多糖等大分子化合物。仪器构造由进样装置、柱