抗体制药课件第三章.pptVIP

选择性培养的基本方法将融合反应后的细胞悬浮液于HAT培养液，加入到含有饲养细胞的96孔板内（0.1ml/孔）。7天内用HAT培养液培养，每2~3天换液一次。换液时吸去1/2~2/3培养液，加入等量的新鲜培养液。第7~14天改用HT培养液，14天以后用普通的RPMI1640完全培养液。融合后培养的第9~11天，就可对所有克隆生长孔的培养上清液进行抗体检测，筛出产生抗体的阳性克隆。030205010401饲养细胞，促进融合细胞的生长。02单个或少数杂交瘤细胞多半不易存活，通常要加入饲养细胞才能使其繁殖。03常用饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞（未经免疫的脾细胞）和胸腺细胞等。04饲养细胞能释放某些生长刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。小鼠腹腔巨噬细胞还具有清除死亡细胞和减少支原体污染的作用。杂交瘤培养物（阳性克隆）的鉴定与检测经培养而得到的杂交瘤细胞，只有一部分细胞可能产生针对特异抗原的目的抗体，因抗体产生细胞只占所有脾细胞的5%左右。因此，在培养9~11天左右，杂交瘤细胞集落直径达1mm时，就应对其能否分泌抗体进行特异性鉴定，以便对抗体分泌阳性的杂交瘤细胞进行克隆化和扩张。检测时，取上清液的一半体积用于抗体测定，其余再补加等量的HT完全培养基。鉴定与检测方法的要求应快速、灵敏、特异性（专一性）强、微量、简便并一次能检测大批标本。常用的检测方法有、抗原直接结合法：适用于检测能与可溶性和颗粒抗原特异结合的抗体。利用第二抗体检测的方法：适用于检测能与可溶性和颗粒抗原特异结合的抗体。有酶联免疫法，放射免疫法，免疫电镜技术，免疫荧光技术。STEP4STEP3STEP2STEP1抗原直接结合法选取相应的纯一抗原，用125I进行标记，然后和杂交瘤细胞培养的上清液混合，在一定温度下反应一定时间（如4℃，1h等）再通过活性炭吸附、PEG6000沉淀或凝胶层析的方法分离未结合的抗原，纯化抗体抗原免疫复合物。最后通过测定其复合物的放射性强弱来进行定性和定量测定。利用第二抗体检测第二抗体：能与抗原和抗体发生免疫反应后形成的复合物进行特异结合的抗体，又称抗抗体应用第二抗体检测杂交瘤分泌的抗体时，需采用免疫标记技术。将第二抗体用125I放射性同位素标记，或与酶连接，或与荧光染料连接，或用电子致密物质加以标记，以提高检测的准确性和灵敏度。具有应用范围广，反应速度快，容易观察，且能进行定量和定性检测的特点。0102免疫荧光技术01是利用结合有荧光素的第二抗体与抗原抗体的免疫复合物特异性结合，再检测荧光强度实现定性定量检测的技术。02常用的荧光素有异氰基荧光素（FIC）、异硫氰基荧光素等。03基本原理：荧光素可与第二抗体球蛋白中赖氨酸的氨基结合，在蓝紫光激发下发射出鲜明的黄绿色或玫瑰红色，而且结合荧光素的第二抗体与抗原抗体复合物结合后仍能发出荧光。04酶联免疫技术01用酶标记抗体或第二抗体来进行抗原抗体反应或第二免疫反应，检测酶标记的抗体或第二抗体是通过酶与特殊底物的反应来进行的（颜色变化，氧化还原电位变化等）。02通常用的酶有：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖苷酶等。03应用发展最快的是酶联免疫吸附法，是检测杂交瘤细胞培养上清液中抗体的一种最有效方法。04放射免疫技术是应用同位素标记的第二抗体与抗原抗体复合物进行特异结合，再通过检测放射强度来进行定性定量检测抗体的方法。具有高灵敏度和血清反应的高特异性的优点。但需要γ-计数器等检测放射性的特殊仪器。免疫电镜技术：是利用电子致密物质标记第二抗体后再与抗原抗体复合物结合，最后用电子显微镜检测的技术。免疫标记技术的方法步骤01将特定的纯一抗原（20μg/ml）吸附在微量滴定板小孔中（每孔50~100μl抗原溶液），37℃温育2h或4℃过夜，倾去抗原溶液，用DPBS缓冲液洗涤小孔3次，这时小孔上已粘附了特定的抗原。02用一种不能与待检测抗体结合的蛋白质饱和小孔内剩余的蛋白质结合位点（1%的牛血清蛋白DPBS缓冲液250μl），然后同样用DPBS缓冲液洗涤小孔3次。03加入待检测的杂交瘤培养上清液（每小孔加入上清液50~100μl），在37℃下温育2h，使待测抗体与抗原充分结合。倾去上清液，用DPBS缓冲液洗涤3次。加入用免疫标记技术标记的第二抗体，使其与已形成的抗原抗体复合物结合，然后用相应的方法检测。如：采用酶联免疫技术01每小孔加入50~100μl酶与第二抗体连接物的溶液，37℃下反应30min，使第二抗体与抗原抗体复合物结合。02然后，再用含0.05%Tween-20的DPBS液洗涤小孔5次，再加入50~