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实验一、微藻原生质体的分离;实验目的

1.了解微藻原生质体分离的原理、方法与技术；

2.熟练、掌握原生质体分离的基本操作过程。;实验原理

根据藻类细胞脱壁程度的不同，Adamich将脱壁后的藻细胞定义为原生质体（protoplast）和原生质球（spheroplast）。原生质体是指任何基因型的藻细胞其质膜外的细胞壁和包被层被全部除去而保持其余细胞组分的部分；原生质球是任何基因型的藻细胞其细胞壁被全部或部分除去，仍保留质膜外包被层的含全部细胞内组分的部分。;海洋微藻因其细胞壁组成的明显差异，原生质体的分离方法很多，例如蓝绿藻的细胞壁含有粘肽，因而可以用溶菌酶处理获得蓝绿藻细胞的原生质体。绿藻的细胞壁主要成分是纤维素，所以可以用纤维素酶处理而获得原生质体或原生质球。硅藻和甲藻因其特殊的细胞壁组成和结构，可用去污剂或富含有机物但缺乏二价阳离子的溶液处理而达到分离原生质体的目的。红藻和褐藻则可用多糖酶消化细胞壁成分来制备原生质体。尽管有这样多的方法，但目前普遍采用的方法是酶解的方法。;仪器与试剂

1、仪器

①恒温水浴；②低速离心机；③冷冻离心机；④离心管40-50ml;⑤三角烧瓶；⑥显微镜，荧光显微镜。

2、试剂与酶

①酶：纤维素酶（OnozukaR-10）,离析酶；②浸透压调节剂：甘露醇、山梨醇和Nacl；③密度勾配剂Ficoll和蔗糖。;实验步骤;（4）在定时取出1ml处理样品，离心分离（1000×g,5min），用MBM液（含0.6mol/l山梨醇）洗涤一次，离心沉淀后，用MBM液（含0.6mol/l山梨醇）重新悬浮。

（5）取0.1ml上述悬浮液再悬浮到0.9ml蒸馏水中，显微镜下观察悬浮液中的细胞。原生质体化的细胞膨胀变大、破裂，可见内容物漏出。

（6）80%以上细胞原生质体化后（1-2h）,将细胞悬浮液置于离心管中配制好的Ficoll不连续密度离心介质（10%-25%）的顶部，10000r/min离心30min。

（7）在15%-20%界面处回收原生质体，用MBM（含0.6mol/l山梨醇）液洗涤原生质体。

;作业;实验二、原生质体培养;实验目的;实验原理;仪器与试剂;实验步骤;注意事项;作业;实验三、海藻种内不同原生质体细胞融合与鉴定;实验目的;实验原理;仪器与试剂;3、培养基和试剂

（1）培养基用原生质体再生培养基。

（2）细胞融合溶液：40%聚乙二醇（PEG）6000,0.55mmol/L山梨醇，50mmol/LCaCl22H2O

（3）清洗液：0.6mol/L山梨醇，50mmol/LCaCl2.2H2O，50mmol/L甘氨酸缓冲液（PH9.0）;实验步骤;作业;实验四、海藻种间原生质体细胞融合与鉴定;实验目的;实验原理;仪器与试剂;3、培养基和试剂

（1）培养基用原生质体再生培养基。

（2）细胞融合溶液：40%聚乙二醇（PEG）6000，0.55mmol/L山梨醇，50mmol/LCaCl22H2O

（3）清洗液：0.6mol/L山梨醇，50mmol/LCaCl2·2H2O，50mmol/L甘氨酸缓冲液（PH9.0）;实验步骤;3、原生质体融合：将紫球藻原生质体与盐藻原生质体1:1混合，然后加入等体积的PEG溶液（组成：0.125mmol/LPEG4000，0.2mol/L葡萄糖，10mmol/LCaCl2.2H2O,0.7mmol/LKH2PO4，pH5.8）。30min后，加入PEG洗涤液（组成：100mmol/L甘氨酸，mol/L葡萄糖，100mmol/LCaCl2.2H2O，pH10.5）。在15min内一滴一滴加入2.5倍体积的PEG洗涤液。洗涤过程中，原生质体融合发生。

4、杂交频率的检测；

5、融合细胞的筛选。;作业;实验五、总RNA抽提与鉴定;【实验目的】

1、学习总RNA分离的原理

2、掌握Trizol法总RNA提取的方法

3、了解各种的不同总RNA提取方法

【实验原理】

TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来获得。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式获得。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。;无论是人、动物、植物还是细菌组织，该方法对少量的组织(50-100mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1g)和细胞(107)均有较