实验三Feulgen反应显示DNA.ppt

实验三

Feulgen反应显示DNA一、实验目的1．掌握临时制片法。

2．熟悉Feulgen反应的原理及操作步骤。

3．观察细胞中DNA的分布DNA经酸（1mol/LHCl）水解后，分子中的嘌呤和脱氧核糖连接的配糖键被打开，脱氧核糖的一端释放出游离的醛基，并在原位与Schiff试剂反应形成特异性的紫红色产物。该产物能特异地吸收550~570nm的光波。并且在一定的浓度范围内对550~570nm光波的吸收值与DNA含量成正比关系，符合化学计量学关系。对照组或采取不经盐酸处理，或预先用热三氯醋酸或DNA酶处理，抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应，从而证明此反应的专一性。此法既可定位用于细胞或组织化学染色反应，观察DNA的分布，又可用显微分光光度计和图像分析仪对细胞或组织中DNA的含量进行定量分析。010302二、实验原理1950年，SwiftH.应用Feulgen显微分光光度法，测定了一些生物各种组织中单个细胞的DNA含量，定义为C值。Feulgen反应对DNA染色稳定、颜色鲜明、能定量，因此在细胞化学和组织化学中成为一个既古老、传统又经久不衰的DNA标记方法。Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠/钾作用，形成无色的品红液。无色品红与醛基结合则形成紫红色的化合物，这是因为反应产物的分子内含有发色基团醌基所引起的。复式显微镜（带油浸物镜）（microscope）l每一组学生擦镜纸；记号笔；小片滤纸；载玻片；镊子；移液枪四膜虫培养液（200μl）；大染色缸：Carnoy固定液；Schiff试剂（铝箔包装）；1mol/LHCl；自来水l?每一个学生恒温水浴锅两台，烘箱一台整个实验班香柏油、二甲苯；小枪头；亮绿?每四个学生三、实验器具与药品四、实验方法

1、细胞标本的制作:（1）每个同学取一片干净载玻片，用移液枪取四膜虫培养物一滴（每片载玻片10μl，移液枪切勿调节超过其量程范围），滴于干净的载玻片的一侧，并用枪头在玻片上涂开成直径约1cm左右的圆。（2）按上述方法再做一片细胞标本作为对照。（3）将标本放在干燥箱中10-15分钟，令样品干燥，细胞牢固贴于玻片。每人做两片：①样品；②对照载玻片02染色缸平面示意图012．固定、染色、观察：以下1~7步操作在染色缸中进行。（注意：载玻片插入染色缸中应插在凹槽中，尽量避免两片载玻片贴在一起，否则会摩擦掉上面的细胞。）(1)将干燥好的2片细胞涂片置于Carnoy固定液中固定20分钟，取出，平置在滤纸上，吸去玻片背面的液体。（滤纸不要擦载玻片正面。）(2)将其中一片标本（样品）放入1mol/L盐酸中，60℃水浴15分钟（注意不要打翻染色缸）；另一片标本（对照）放在空气中，令其自然干燥。(3)将以上两标本同时放入Schiff氏液中作用45分钟（30℃培养箱）。（注意不要搞混样品和对照。）(4)自来水浸泡1分钟，提出载玻片，平置在滤纸上。（5）倒去染色缸中液体，再加入干净的自来水，重复（4）操作。(6)0.1％亮绿水溶液复染2秒钟（将载玻片浸入溶液后随即提出）。(7)在干净的自来水稍加浸泡，去掉浮色，滤纸吸去玻片背面和两侧的水分。（滤纸不要擦载玻片正面）(8)空气中干燥，显微镜观察。比较两个标本的差异。实验流程涂片（2片/人）样品对照干燥盐酸水浴60℃15mSchiff试剂30℃45m对照片空气干燥自来水浸洗1m/两次亮绿复染2sCarnoy固定20m自来水浸洗去浮色干燥镜检介绍：RNA染色——Brachet反应甲基绿-派洛宁为碱性染料，它能分别于细胞内的DNA和RNA结合而呈现不同颜色。当甲基绿与派洛宁作为混合染料时，甲基绿与染色质中的DNA选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择结合显示红色。其原因可能是两种染料的混合染液中有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。甲基绿易于聚合程度高的DNA结合呈现绿色，而派洛宁则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色，但解聚的DNA也能与派洛宁结合呈现红色。总的说来，RNA对派洛宁亲和力大，被染成红色，而DNA对甲基绿亲和力大，被染成蓝绿色。蟾蜍血细胞Brachet染色蓝绿色部分为DNA，红色部分为胞质和核仁的RNA介绍：四膜虫（Tetrahymena）四膜虫与草履虫一样，都是单细胞原生动物，属纤毛虫纲。一般呈梨形。四膜虫有两个细胞核，大核位于细胞中部，直径约10微米，小核位于大核附近，直径为1.52微米。小核具5对染色体，其基因不转录，对细胞表型无影响。在有性生殖