第04章-蛋白质的共价结构ppt课件.pptxVIP

第三节蛋白质的共价结构(一级结构）;基本要求

1.肽的结构特点、基本性质

2.蛋白质一级结构测定方法

3.一级结构与生物功能关系，有关典型例子;;一肽与肽键的结构：

氨基酸残基（aminoacidresidues）

肽链的极性

N-端（左）、C-端（右）

多肽链的一端含有一个游离的?-氨基，称为氨基端或N-端。另一端含有一个游离的?-羧基，称为羧基端或C-端。

氨基酸序列是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。

肽基(peptidegroup):也称肽单位,肽链中的酰氨基(-CO-NH-);（酰氨键）

肽键：AA间脱水后形成的共价键;;;;肽平面示意图;肽平面：也称肽基平面、酰胺平面。

肽键的平面性质在肽链折叠成三维结构中是很重要的。;（二）肽的理化性质;（二）肽的理化性质;（二）肽的理化性质;（二）肽的理化性质;（二）肽的理化性质;（二）肽的理化性质;（三）天然存在的活性肽;（三）天然存在的活性肽;GSH（还原型）

三肽;Glu-?-Cys-Gly

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S

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S

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Glu-?-Cys-Gly;生理功能;L-Aspartyl-L-phenylalaninemethylester;+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-Met-脑啡肽

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Leu-脑啡肽;抗革兰氏阳性菌

治疗化脓性病症;蛋白质

氨基酸残基数在50个以上，具有特定空间结构的肽。

多肽

氨基酸残基数在50个以下，无特定空间结构的肽。;三、蛋白质一级结构的测定;二硫键的数目和位置;1测定多肽链的数目;准备工作（一）：

样品的分离纯化和纯度鉴定纯度＞97%

检测蛋白质样品纯度的方法：

（1）电泳

（2）层析

（3）N-末端氨基酸的测定

（4）等电点沉淀

（5）纯化至恒定的比活;准备工作（二）：

确定相对分子量误差10%

（1）凝胶过滤

（2）沉降分析法

（3）SDS（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）;测定要求;1、测定蛋白质分子中多肽链的数目

测定末端AA的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系

确定多肽链的数目

;2、多肽链的拆分

多条多肽链组成的蛋白质分子，必须拆分;2.多肽链的拆离P171

1).亚基拆分:

①PH改变:PH10;PH3

②强变性剂：脲（8M）；盐酸胍（6M）

③高浓盐

2).二硫键拆??

氧化:过甲酸，不再重新生成-S-S-

还原:DTT；巯基乙醇→加碘乙酸等烷基化试剂→封闭SH

烷基化试剂：碘乙酸，碘乙酰胺，环乙烯亚胺

3).肽链分离和鉴定

分离:层析电泳

鉴定:SDS；N-末端分析;寡聚蛋白质：多肽链以非共价键连接

血红蛋白（四聚体）、烯醇化酶（二聚体）

8mol/L尿素

6mol/L盐酸胍;2）二硫键的断裂

几条多肽链通过二硫键交联

8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下

过量的?-巯基乙醇处理

二硫键还原为巯基

烷基化试剂保护巯基，防止重氧化;;

;3.肽链aa组成的测定：

1)蛋白水解:

酸解法；碱解法；

5.7N恒沸HCL①Trp100%被破坏

酸解：Pr溶液105-110℃20-72h②二硫键解离

③AsnGln→AspGlu

④SerThrTyrLys部分破坏

2)aa定性和定量：

定性:纸层析；薄层层析；高压纸电泳

定量：柱层析(离子交换原理);3、测定各多肽链的AA组成

并计算出氨基酸成分的分子比;4、分析多肽链的N-末端和C-末端;末端氨基酸：N-端A(amino-terminal)、C-端AA

最重要的是N-端AA分析法;?二硝基氟苯（DNFB）法;丹磺酰氯与N-端AA的游离氨基作用，丹磺酰-AA

优点：丹磺酰-AA强荧光，检测灵敏度达10-9mol;C-端AA分析法

多肽与肼在无水条件下加