实验二基因克隆.ppt

实验二基因克隆（一）基因组DNA的提取和限制性内切酶酶切分析实验目的掌握基因组DNA制备的原理和方法了解DNA限制性内切酶作用特点和酶切消化的操作步骤实验原理真核生物染色体DNA组装不同层次的结构基因组DNA的提取和纯化保持核酸分子一级结构的完整性；01排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染；02无杂核酸分子的污染（如纯化DNA分子时应去除RNA分子）；03核酸分离、纯化原则01匀浆组织，破碎细胞02去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子03沉淀核酸04去除盐类、有机溶剂等杂质05纯化干燥06溶解基因组DNA制备的基本思路02酚/氯仿抽提去除与DNA结合的蛋白质酚是很强的蛋白质变性剂，氯仿能加速有机相与水相分离，溶解去除残留的酚，且可以去除蔗糖等，在氯仿中加入少量异戊醇可减少蛋白质变性过程中产生的大量气泡。03乙醇和醋酸钾沉淀核酸核酸为水溶性，在有机溶剂和高盐存在下，核酸在水中的稳定性被破坏，呈不溶状态而沉淀下来。蛋白酶K和SDS破碎细胞在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分子分离，EDTA抑制细胞中DNase活性，蛋白酶K将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。01注意事项尽量在低温下进行操作；避免物理因素对核酸的机械剪切；防止过酸、过碱引起核酸降解，控制pH值范围（pH值5-9），并要保持一定离子强度；防止核酸的生物降解；细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。因此，所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中。2.DNA限制性内切酶酶切分析基因工程pUC18的酶切图谱一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶；01来源于原核生物，功能类似高等动物的免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭；02水解核酸链中的磷酸二酯键；03DNA的限制性内切酶酶限制性内切酶可分为三类限制性内切酶酶分子识别位点切割位点限制作用是否需用ATPⅠ类三亚基双功能酶二分非对称至少在识别位点外1000bpYesⅡ类内切酶与甲基化酶分子不在一起4-6bp,大多数为回文对称结构在识别位点中或靠近识别位点无特异性NoⅢ类二亚基双功能酶5-7bp非对称在识别位点下游24-26bpYes