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cre_loxp基因敲除系统解读
背景介绍
年等首次在体
1981Evans1985年Smithies最早在哺乳动物
外分离和培养ES，成功建细胞中发现并实现了同源重组
立了小鼠胚胎干细胞系
一、Cre/Loxp系统
nCre重组酶（37℃）
Ø位点特异性重组酶，介导loxp
位点间的序列同源重组
Ø70%重组率，无需辅助因子，多种
P1噬菌体
结构的DNA底物
nLoxpsite
Ø34bp反向重复序列
nFlp/Frt重组系统
（1）重组方式
（2）基因敲除机理
Offspring：50%heterozygousknockoutafter1generation
基因敲除机理（续）
Offspring:25%homozygousknockoutafter2generation
二、基因敲除的基本流程
（1）打靶载体构建
Attention:
Exon1
3N
GT/AG
ConditionalKnockout
（2）转化ES细胞
电转需要的细胞数量2-5x107
电穿孔或是显微注射方法将构
建好的打靶载体导入ES细胞
（3）阳性克隆筛选
Ø随机整合
Ø定点整合
Ø没有整合
DTA(白喉毒素A亚基）
（4）囊胚注射
小鼠的遗传背
景取决于ES和
囊胚细胞
（5）嵌合体小鼠
（6）品系纯化
纯合突变小鼠用来和Cre小鼠杂交，杂合突变小鼠保种
Loxp2小鼠品系建立完成
三、Cre工具鼠的构建
DNA显微原核注射，是指将外源DNA通
过显微注射的方法注射到受精卵的原
核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的
基因组中，并稳定遗传给后代。
诱导性组织特异性Cre工具鼠的载体构建
MHC(cardiac-specifica-myosinheavychain)
Mer(mutatedmurineestrogenreceptorligand-bindingdomainamino
acids281to599,G525R)
D.S.Sohal,M.Nghiem.Temporallyregulatedandtissue-specificgenemanipulationsintheadult
andembryonicheartusingatamoxifen-inducibleCreprotein.CircRes.89:20-25(2001).
MerCreMer融合蛋白
该系统将雌激素受体(EstrogenReceptor,ER)的配
体结合区(ligand-bindingdomain,LBD)和Cre重组
酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重
组酶的表达被置于特异启动子的调节之下，从
而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产
生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组
酶的活性，因为雌激素受体结合区的存在使其
不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌
激素后才能使其进入核内发挥作用。
TheEnd
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