实验二蛋白质的颜色反应及蛋白质含量测定.ppt

蛋白质没有专一的颜色反应，常用的颜色反应是蛋白质中某些结构单元的特征反应，发生某些颜色反应只能说明某些结构单元的存在。颜色反应是一些常用蛋白质（其肽链已知）定量测定的依据。都是由一个氨基、一个羧基、一个氢原子和一个侧链基团（R）连接在同一个碳原子上构成，这个碳原子叫α-碳原子反应名称反应基团反应操作反应产物及现象用途1双缩脲反应肽键NaOH及CuSO41ml样+2ml0%NaOH+2dCuSO4Cu–Cu—双缩脲络合物（兰紫色）测蛋白质含量鉴定蛋白质水解是否完全2茚三酮反应α-氨基酸0.5ml茚三酮试剂+1ml样兰紫色测AA含量检验AA及蛋白质3黄色反应苯环、Try、Tyr1ml样+3~4d浓HNO3观察再加NaOH，再观察黄色硝醌酸生成鉴定Try、Tyr4坂口反应胍基样1ml+5d15%NaOH+2d1%α-萘酚+6d次溴酸钠玫瑰红色产物生成鉴定Arg测定Arg含量5乙醛酸反应吲哚环样1ml+2ml冰乙酸+浓HSO4(沿壁且不能混匀)微热中间生成兰紫色环鉴定Try6偶氮反应咪唑基样1ml+偶氮试剂与20%NaOH1ml有橙色和鲜红色产物生成鉴定His、Tyr7醋酸铅反应巯基、CySCySH0.5%Pb(AC)2+10%NaOH+1ml样+加热后再加HCl闻其味黑色PbS生成臭鸡蛋味鉴定含硫AACyS、CySH双缩脲试剂配制中，加入CuSO4后加入氨水，目的是生成氨铜络合物，再加入冷水，防止少量CuOH2在加热时（加入饱和NaOH会有热量产生）变为黑色的CuO，NaOH提供碱性环境。茚三酮反应，即：所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质。在570nm波长下进行比色就可测定样品中氨基酸的含量，也可以在分离氨基酸时作为显色剂对氨基酸进行定性或定量分析。在多肽合成中常用来检验有无自由氨基的肽类存在在法医学上，使用茚三酮反应可采集嫌疑犯在犯罪现场留下来的指纹。因为手汗中含有多种氨基酸，遇茚三酮后起显色反应。苯酚及某些二羟苯衍生物中加入米伦试剂(硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物)后产生白色沉淀，可能是羟苯之亚硝基衍生物，经变位作用变成颜色更深的邻醌肟，最终得具有稳定红色的产物。含有酚基的化合物都有这个反应，故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都能与米伦试剂反应。（溶液中不能含有大量无机盐、H2O2、醇或碱，因它们能使汞变成沉淀，中和碱时不能用HCl）含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橘黄色的硝醌酸钠。多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。例如皮肤、指甲、毛发等遇浓硝酸变黄。蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH—)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。BCA快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便?经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量?不受样品中离子型和非离子型去污剂影响?检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如折射率、比重、紫外吸收等测定而得知：或用化学方法，如定氮、双缩脲反应、Folin-酚试剂反应等方法来求算。其中双缩脲法和Folin-酚法是一般实验室中经常使用的方法。它们操纵简便、迅速，不需要复杂而昂贵的设备，又能适合一般实验室的要求，若作一般的浓度测定较为适应。Folin-酚法灵敏度高，较双缩脲法灵敏100倍。考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’slaw）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595n