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实验五

BCA法测定蛋白质浓度;实验目的;四种古老的经典方法：

凯氏定氮法

双缩脲法（Biuret法）

Folin－酚试剂法（Lowry法）

紫外吸收法

新的测定法：

考马斯亮蓝法（Bradford法）

更新的测定方法：

BCA法

;凯氏定氮法（Kjeldahlmethod，全称凯耶达尔定氮法）是分析化学中一种常用的确定有机化合物中氮含量的检测方法。这种方法是由凯耶达尔在1883年发明的。

在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定(16%)，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。

;若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则样品中蛋白质含量（%）=总氮量×6.25

???

若样品中除有蛋白质外，尚含有其他含氮物质，则需向样品中加入三氯乙酸，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。

???蛋白氮=总氮-非蛋白氮

???蛋白质含量（g%）=蛋白氮×6.25

凯氏定氮法的普遍适用性、精确性和可重复性已经得到了国际的广泛认可，它已经被确定为检测食品中蛋白质含量的标准方法。;蛋白质浓度测定方法---双缩脲法;蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。

吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。

蛋白质浓度(mg/ml)=1.45OD280-0.74OD260

;也称考马斯蓝染色法。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm，当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定，该法是1976年Bradford建立。;试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

考马斯亮蓝有G250和R250两种。其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。;BCA(bicinchoninincacid，二喹啉甲酸)与二价铜离子的硫酸铜等组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。

操作简便，快速，灵敏度高，准确，试剂稳定性好，经济实用，抗干扰能力强。

;;实验步骤;3.将稀释后的标准品（0.5mg/ml）按0,2,4，6，8,12,16,20微升分别加到96孔板的蛋白标准品孔中，加标准品稀释液补足到20微升。;4.加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液补足到20μl。(将蛋白质样品作适当稀释)

5.?各孔加入200μl升BCA工作液，用加样枪轻轻吹打混匀（注意：不要弄出气泡影响读数），37℃放置30-60分钟。

6.冷却到室温后，用酶标仪测定A562nm，或540-590nm之间的其他波长的吸光度，根据标准曲线计算出蛋白浓度。;请大家批评指正