微量克氏定氮法定量测定蛋白质含量.pptVIP

微量克氏定氮法测定蛋白质含量一、实验目的掌握微量克氏定氮法定量测定蛋白质含量的原理和操作技术。PART.01二、实验原理天然含氮有机化合物（如蛋白质）与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在克氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸气蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量（mol）相当于被测样品中氨的量（mol），根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。因为蛋白质含氮量通常在16%左右，所以将克氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。应过程可分为消化、蒸馏及滴定三大步骤。浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳和水，氮转变出的氨，进一步与硫酸作用生成硫酸铵，此过程通常称之为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以加快反应速度。以甘氨酸为例，其消化过程可表示如下：CH3NH2COOH+3H2SO4→3CO2+3SO2+4H2O+NH3（1）2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4??????????????????????????????????????（2）(NH4)2SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH3?????????????（3）1）、（2）在克氏定氮烧瓶中完成。反应（3）在克氏定氮仪内进行。浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨。借水蒸气将产生的氨蒸馏到定量、定浓度的硼酸溶液中，氨与溶液中的氢离子结合生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。然后用标准无机酸滴定至恢复溶液中原来氢离子浓度为止。最后根据所用标准酸的摩尔数计算出待测物中的总氮量。三、实验器材微量克氏定氮仪：参见图5-1，1套/组。克氏定氮烧瓶：2只/组。取样器：，5mL、1mL各1只/组。使用指南：接好套头（不漏气）→通过旋钮调节容量（如500表示5mL）→用活塞第一挡吸液→用活塞第一挡和第二挡放液→换套头→继续使用。注意，平时取样器应挂在架子上，绝不可倒置，以免溶液倒流入枪体中而损坏仪器。电炉：公用。5．1．微量滴定管（5mL）：1只/2组。酒精灯：1只/组。锥形瓶（100mL）：4只/组。铁架台、十字夹、龙爪、打火机、表面皿、吸管、量筒等。五、实验操作.消化：将两个50mL的克氏定氮烧瓶编号（在烧瓶口附近），一只烧瓶内加1.0mL蒸馏水，作为空白。另一只烧瓶内加入1.0mL样液（卵清蛋白液）。然后用取样器各加浓硫酸2mL（取浓硫酸时勿溅到衣物和皮肤上，也不要洒到实验桌上），用药勺加硫酸钾－硫酸铜混合物约20mg（不必称重，一点点即可），所有试剂要尽量加到克氏定氮烧瓶的底部。烧瓶口插上小漏斗（作冷凝用），烧瓶置通风橱内的电炉上加热消化，参见图5-3，注意先启动抽风机。消化时间为2～4h。在消化时可以同时进行第二步。消化装置.蒸馏：取100mL锥形瓶3只，洗涤干净，用取样器各加入2%硼酸溶液5.0mL，加入几滴指示剂，溶液显紫色，用表面皿盖好备用。如锥形瓶内液体呈绿色，需重新洗涤。安装好微量克氏定氮仪。微量克氏定氮仪实际上是一套蒸馏装置，，注意保证每个夹子夹紧而不漏气，保证加样口的小漏斗口朝上并斜靠在定氮仪上（这可以通过调整其下方夹子的方位来实现）。蒸馏瓶的洗涤#2022把装有5.0mL的2%硼酸溶液的锥形瓶9置于冷凝器的下方，将冷凝器下方的导管12下端插入液面以下，锥形瓶内须事先加入指示剂（注意此时的颜色，它将是后面滴定终点的颜色）。先将克氏烧瓶中消化好了的空白消化液由小漏斗3注入到蒸馏瓶的反应室1中，用蒸馏水洗涤克氏烧瓶2次（每次约2mL），洗涤液皆由漏斗3注入反应室1。用取样器取40%氢氧化钠溶液10mL，注入小漏斗（小漏斗必须始终保持口朝上的状态），放松夹子，使其缓缓流入反应室1。当小漏斗内仍有少量NaOH溶液时，立即夹紧夹子（以上操作勿将NaOH溶液溅到衣物和皮肤上，也不要洒到实验桌上）。再加约3mL蒸馏水于小漏斗内，同样缓缓放入反应室，并留少量水在漏斗内作水封。把所有夹子夹紧，打开冷凝水，开始用酒精灯加热，将蒸馏瓶夹层2内的水煮沸。注意，在样品蒸馏的整个过程中，要保持火苗的稳定，严禁中途移去火源，以防倒吸。从蒸馏瓶内的水溶液沸腾开始计算时间，大约10min即可蒸馏完毕。将导管12的下端抽出液面，继续蒸馏1min，使导管内的余液落回锥形瓶9中，移开锥形瓶，用表面皿盖好等待滴定。移去火源，反应室1中的残液将会倒流至夹层2中，由8排出。将蒸馏瓶洗涤2～3次，并将反应室1清空，按空白蒸馏的方法进行样品蒸馏。