抗原的表达和纯化.ppt

抗原蛋白的表达和纯化一、抗原组生产流程Ag组的操作流程菌种接种培养过夜扩大培养诱导继续培养收集菌体破碎菌体离心沉淀包涵体纯化步骤可溶性蛋白纯化步骤上清可溶蛋白具体生产步骤1、接种80ul菌种至100ml抗性培养基中，37度培养过夜。2、次日加入新鲜抗性培养基至600ml，培养1.5小时至活力最旺盛。3、加入0.5mM的IPTG诱导3.5小时4、收集菌体（66转/秒×15min),弃上清，加入PBST悬浮菌体，加入200ulMPMSF,100ulEDTA(his标签蛋白不加），冰浴下超声破碎细胞。5、摇床4度孵育1小时。6、高速离心，133转/秒×15min。取上清，加入600ulbeads结合过夜。7、收集beads（33转/秒、瞬时），洗涤液洗涤3次。加入300ul洗脱液，4℃振荡洗脱1小时，瞬时离心，取上清。再次加入300ul洗脱液，洗脱1小时，两次洗脱液合为一管。8、将所得的上清取10ul加入10ulsamplebuffer制样，SDS跑胶。9、根据maker的跑胶结果目测蛋白质量及浓度。01020304基因的表达亲和层析纯化可溶蛋白包涵体的纯化原理SDS－PAGE电泳的基本原理二、实验原理在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因称为可诱导基因。可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导。01如果基因对环境信号应答是被抑制，这种基因是可阻遏基因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏。02原核生物的基因调控主要发生在转录水平上。原核生物的基因表达主要是负性调控，诱导物可用于去除阻遏作用。03公司构建的基因工程菌采用乳糖操纵子调控系统。04三、基因的表达（一）乳糖操纵子(lacoperon)的结构调控区CAP结合位点启动序列操纵序列调节基因ZYAOPDNAI结构基因Z：β-半乳糖苷酶Y：透性酶A：乙酰基转移酶（二）阻遏蛋白的负性调节mRNA阻遏蛋白阻遏基因IDNAZYAOP没有乳糖存在时pol启动转录有乳糖存在时IDNAZYAOPpolmRNA阻遏蛋白mRNA乳糖别乳糖β-半乳糖苷酶CAP(cataboliteactivatorprotein,分解代谢物激活蛋白)涉及到正性调节.CAP又称为CRP(cAMPreceptorprotein),lacoperon高水平转录必需的一个激活蛋白。葡萄糖抑制cAMP的形成。葡萄糖存在时，cAMP浓度低；仅在葡萄糖消耗完毕时,cAMP浓度增高。（三）CAP/CRP的正性调节++++转录无葡萄糖，cAMP浓度高时促进转录ZYAOPDNACAPcAMPCAPcAMPCAPcAMPCAP结合位点lacI-系统中，不管是否存在乳糖，三种乳糖分解代谢有关的酶得到持续表达。lacI+系统中，当葡萄糖存在时，不表达三种酶；然而，当存在乳糖而又缺乏葡萄糖时，这三种酶得到表达。乳糖操纵子受到两种调节：阻遏蛋白的负调节和CAP的正调节，有两道控制开关，只有两道开关同时打开时,即只有在缺乏葡萄糖并存在乳糖时,基因才能够转录。mRNAZYAOPDNAImRNA阻遏蛋白乳糖别乳糖β-半乳糖苷酶CAPcAMPCAPcAMPpol启动转录CAPcAMP（四）乳糖操纵子诱导物由于乳糖虽可诱导酶的合成，但易被β-半乳糖苷酶催化降解，并且产生很多复杂的动力学问题，因此人们常用安慰诱导物诱导。乳糖操纵子的安慰诱导物除了异丙基巯基半乳糖（IPTG)，还可以是巯基半乳糖苷（TMG）、O-硝基半乳糖苷（ONPG)。IPTG为常用的诱导物，是一种十分有效的乳糖操纵子的诱导剂,可与阻遏物结合促进基因的表达。IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被运送，不被大肠杆菌所分解所以浓度并不改变IPTG浓度：0.1-1mM0.5mM诱导温度:28℃37℃诱导时间:3.5h（五）影响蛋白表达的因素四、亲和层析纯化可溶性蛋白目前我们公司生产的抗原绝大部分是谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白和6XHISTag融合蛋白。融合蛋白的优点有：(1)表达效率高；(2)产生的融合蛋白比天然蛋白更稳定，融合蛋白是避免细菌蛋白酶降解的最好措施；(3)产生的蛋白质易于鉴定，纯化。GST-tag序列可以增加融合蛋白的溶解性。His-tag表达方便而且基本不影响蛋白的活性亲和层析是利