抗原抗体的纯化.ppt

表3-16亲和层析中部分蛋白配体配基纯化的物质蛋白A/蛋白B各种免疫球蛋白单克隆抗体各种抗原、蛋白A抗原特异性单克隆抗体、特异性多克隆抗体核苷酸核苷酸结合蛋白、核苷酸酶血凝素糖蛋白蛋白酶抑制剂蛋白酶脂肪酸脂肪酸结合蛋白、清蛋白糖血凝素、糖苷甘酶生物素亲和素、生物素结合蛋白肝素凝血因子、酯酶、DNA聚合酶、连接组织蛋白酶钙调蛋白钙调蛋白结合酶Triazine染料脱氢酶、激酶、多聚酶、干扰素、限止酶等01一种可应用的亲和纯化标签：6组氨酸标签03在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合02组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子04在低pH下用咪唑竞争洗脱蛋白质用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的方法有：（四）脱盐**透析法01超滤法02葡聚糖凝胶G50层析法。03二、有机溶剂沉淀法**利用待分离物质与杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使某一溶质沉淀析出，从而与其它成分分离的方法。有机溶剂破坏溶质分子周围的水化层；有机溶剂降低溶液的介电常数，使蛋白质的溶解度降低。优点：分辨率比盐析法高，即一种溶质发生沉淀的有机溶剂浓度范围比较窄；溶剂容易除去，并可以回收；沉淀无需脱盐，易于离心或过滤分离。缺点：有机溶剂可使某些生物大分子变性失活，操作常需在低温下进行；有机溶剂具有一定毒性（二）有机溶剂的选择**选择有机溶剂的原则：有机溶剂的水溶性好；沉淀效率高；毒性小，避免损害工作人员的健康和污染环境；不与溶质分子发生化学反应，价格便宜。使用较多的是乙醇、丙酮、甲醇等。残留的有机溶剂去除的方法：**自然蒸发或负压蒸发，可在室温进行；01凝胶过滤除去。02（三）影响有机溶剂沉淀的因素**pH：一般是欲分离物的pI（等电点）。样品浓度：过高过低均不好，0.5%~2%离子浓度：有机溶剂在中性盐存在的条件下可以减少蛋白质的变性，提高分离效率。需加0.05mol/L左右的中性盐。温度：实验要求在低温条件下操作，有机溶剂需预冷至较低温度。有机溶剂的浓度：有机溶剂的用量一般为溶液体积的2倍左右，有机溶剂的浓度约为70%。金属离子：一些多价阳离子如Zn2+、Cu2+和Ca2+，辅助沉淀123456三、非离子聚合物沉淀法**用聚乙二醇（PEG）等非离子聚合物沉淀生物大分子。主要优点：沉淀条件温和，不易引起生物大分子的变性；沉淀效率很高，很少量的非离子聚合物则可以沉淀相当多的生物大分子；沉淀物中的多聚物容易除去。广泛应用于蛋白质、核酸、酶、细菌和病毒的分离纯化。其作用原理类似有机溶液，但使用浓度较低。较麻烦的是PEG不易由蛋白质沉淀中除去，幸而PEG通常并不影响下一步纯化步骤影响因素：**离子强度：低离子强度（0.3以下）对沉淀影响不大，高离子强度（2.5以上）则影响沉淀，使分段效果不明显。样品分子量：样品分子量越大，在一定PEG浓度下的溶解度越低，越易被沉淀出来。pH：溶液pH越接近被分离成分的等电点，所需PEG浓度越低。样品浓度：样品浓度高易于沉淀，但过高会使分子在不同PEG浓度下出现沉淀的分段作用减弱，降低分辨率。一般低于10mg/ml为好。PEG聚合度：PEG聚合度越高，沉淀样品所需PEG的浓度越低。但PEG聚合度过高，溶液粘度过大，不易操作。常用吸附法、乙醇沉淀法、或盐析法除去沉淀物中大量的聚乙二醇第三节离子交换层析法（ionexchangechromatography，IEC）是利用离子交换剂上可交换离子与组分中的离子发生可逆交换时结合力的差别，而进行分离的一种技术。广泛应用于很多生命物质的分析、制备和纯化等。优点：**重现性好，简单易行；分辨力强，回收率高；具有多孔性，表面积大、交换容量大；具有亲水性，对大分子的吸附不牢固，层析条件温和，不致引起物质变性或失活。一、基本原理**离子交换法的固定相是离子交换剂；若担体带有正电荷，可吸附着负电荷分子，则为阴离子交换法；不带净电荷的分子，以及阳离子则直接流出，不会被吸附上去。这些被固相单体所吸附的离子，统称为counterion，因为其电荷与担体上的电荷相反(counter是相反的意思)离子交换剂为人工合成的惰性高分子聚合物，其上带有许多可电离基团，根据这些基团所带电荷的不同，可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。它可分三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。12阳离子交换反应：R-A-H++