形态学实验技术.ppt

生物素标记的第二抗体室温30-60minPBS洗涤。ABC复合物1:100－1:150（A和B液于临用前等量混合）370C60min或40C过夜。PBS洗涤。DAB-H2O2显色（镜检控制），水洗、复染、封片。二、标记生物素—抗生物素法（LAB）原理用生物素标记抗体为一抗体，以酶标记抗生物素为第二抗体，经成色反应而显示抗原物质。特点:方法简便，但灵敏度低。01酶呈色反应。切片在含有1:100生物素标记的第一抗体孵育1h,室温。PBS洗2次，每次5min。用1：200过氧化物酶标记的抗生物素液孵育45min，水洗。020304LAB法操作流程SP法采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来检测细胞和组织中的抗原。特点:1.高敏感性;2.低背景;3.简便快速;结果稳定020103三、SP免疫组化染色原理SP法原理修复抗原0.3%过氧化氢室温10min非免疫血清室温5—30min特异性免疫抗体(一抗)37℃60min或4℃过夜脱蜡至水0201030405SP法操作流程Biotin—IgG（二抗）37℃30—40minStraptavidin—HRP37℃40—50minDAB显色各步间均以PBS液充分洗涤0103021免疫细胞化学的突出优点是：2高度的特异性3抗原抗体反应是特异性最强的反应之一，细胞化学所用的抗体必须是特异性强的多价或单价抗体，具有高度的认别能力，在抗原识别上可达到单个氨基酸的水平，这是其它组织化学方法难以相比的。敏感性高免疫细胞化学采用各种有效方法最大限度保存细胞和组织内待检物的抗原性，采用多种增敏方法，使用高度敏感的和高亲和力的抗体，保证检出细胞内超微量的抗原分子，用显微镜和电子显微镜观察结果，因此它是在细胞、分子水平或基因水平的检测技术。第二步第一步既可定位、定性又可定量免疫组化技术用于组织或细胞成分定性、定位及定量的研究方法步骤统一虽然免疫组化技术的方法很多，但基本程序相同只要掌握了原理和一种方法，其它方法大同小异。有关的免疫学理论01抗原、抗体的概念及抗原抗体的关系02抗原(Antigen)凡能刺激机体产生抗体，并能与抗体发生特异性结合的物质称为抗原。物质所具有的这种特性称为抗原性。抗原可以是可溶性物质（如病毒和蛋白质）或微粒（细菌或组织细胞）。也可有外源性和内源性之分。03抗体(Antibody)是机体受抗原刺激后，在体液中出现的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，称免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)。含有免疫球蛋白的血清称免疫血清。人类免疫球蛋白有五类即IgG,IgM,IgA,IgE,IgD。01抗体的种类：根据获得抗体的途径或来源不同分类02免疫抗体，天然抗体，自身抗体，完全抗体，不完全抗体。03抗原与抗体的关系抗原是引起机体产生免疫反应的主要外因，决定免疫反应的特异性，机体与抗原物质的斗争过程中为加速循环和排除抗原而产生的抗体、致敏淋巴细胞等物质，是机体排除异体物质的保护性反应。没有抗原的刺激，机体不能产生抗体；利用抗体可以检测抗原物质。01根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为免疫荧光细胞化学技术；免疫酶细胞化学技术；免疫铁蛋白技术；免疫金—银细胞化学技术；亲和免疫细胞化学技02术；免疫电子显微镜技术等。免疫细胞化学的分类不同的免疫细胞化学技术，各具有独特的试剂和方法，但其基本技术方法是相似的，都包括:抗体的制备，组织材料的处理，免疫染色、对照试验、显微镜观察等步骤。目前国内外市场各种特异性抗体日益增多，可直接应用市售产品。我国自制抗体种类较少。免疫染色可在细胞涂片或组织切片上进行免疫染色。一般程序是：标记抗体与标本中抗原反应结合；用PBS洗去未结合的成分；直接观察结果(免疫荧光直接法)；或显色后再用显微镜观察(免疫酶直接法)。在此基础上发展出间接法，多层法，双标记法等各种方法。第二节免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术(immunofluorescencecytochemistrytechnique）是将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再与组织切片或涂片中相应的抗原或抗体起反应，从而使形成的免疫复合物上带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下借助紫外光激发呈现出黄绿色或橘红色荧光，由此检测抗原或抗体并定位。此方法称荧光抗原（抗体）法。以荧光抗体方法较为常见。直接法:用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异性荧光抗体。直接用于组织抗原的检查。常用于肾穿和病原体的检查。间接法：是直接法的重要改进。先用特异性抗体（