《RNA建库流程》课件.pptVIP

**********************RNA建库流程RNA建库是从RNA提取开始的一系列实验流程,用于分析和研究RNA分子的结构和功能。这个过程涉及多个关键步骤,如RNA提取、反转录和文库构建等,需要严格操作以确保结果的准确性和可靠性。RNA提取概述核酸提取从各种生物样品中提取高纯度的RNA是后续实验的基础。实验技术RNA提取采用离心柱吸附、化学裂解等多种成熟技术。质量检测对提取的RNA进行浓度、完整性等多指标测定以确保质量。RNA质量控制良好的RNA质量是进行后续分析的前提。通过对提取的RNA进行质量检测和评估,可以确保实验的可靠性。常用的质量检测方法包括紫外分光光度计法、凝胶电泳法和微流控芯片电泳法。检测指标合格标准作用浓度≥50ng/μl提供足够的模板用于后续分析纯度(A260/A280)1.8-2.2评估RNA是否含有蛋白质或其他杂质污染完整性(RIN值)≥7判断RNA分子链是否完整,评估RNA样品的质量rRNA去除方法亲和层析法利用特异性结合探针捕获并去除rRNA分子,可以高效去除样品中的rRNA片段。酶切法采用特异性的核酸内切酶切割rRNA分子,有效降低rRNA在总RNA中的比例。差减法通过差减杂交排除rRNA序列,可以大幅提高转录组测序中mRNA的检测覆盖率。磁珠分离法利用磁珠上连接的rRNA特异性探针捕获并分离rRNA分子,提高了纯度和效率。弹性测序建库流程样品准备根据不同样品类型进行适当的RNA或DNA提取。确保获得足够高质量的核酸。片段化使用酶或机械方法将核酵分解成所需长度的片段。控制好片段大小分布。末端修复采用特殊酶对片段末端进行修复和磷酸化,为后续连接接头做准备。文库构建将修复后的片段与特异性接头连接,形成初步的测序文库。优化连接条件。扩增与纯化进行PCR扩增和磁珠法纯化,获得高质量的文库供后续测序。总RNA转录本建库步骤1总RNA提取使用TRIzol等试剂从样品中提取总RNA2DNA去除使用DNaseI处理去除DNA污染3poly(A)选择利用oligo(dT)磁珠富集poly(A)+RNA4第一链cDNA合成以poly(A)+RNA为模板,合成第一链cDNA总RNA转录本建库的关键步骤包括总RNA提取、DNA去除、poly(A)+RNA富集,以及第一链cDNA合成。这些步骤确保得到高质量的mRNA做为测序文库的模板。后续流程还包括第二链cDNA合成、片段化、末端修复、接头连接等操作。小RNA建库步骤1总RNA提取从样品中分离并纯化总RNA2rRNA去除去除核糖体RNA,富集小RNA分子33接头连接使用特异性接头连接至小RNA末端4逆转录及扩增将小RNA转录为cDNA并进行PCR扩增5文库构建将cDNA片段连接上测序接头以构建文库小RNA建库流程关键在于从总RNA中有效分离富集小RNA分子,并通过接头连接、逆转录等步骤构建出可用于测序的文库。这一过程需要特异性的试剂和仔细的操作,以保证获得高质量的小RNA文库。有取向性的建库流程1模板RNA定向利用附加引物或特殊测序接头的设计,可实现RNA序列的方向性定义。确保最终测序结果能反映原始RNA分子的5-3极性。2cDNA合成定向通过使用引物附加序列或特殊酶切位点,在cDNA合成过程中即可记录RNA链的5-3方向。这为后续测序分析提供了宝贵的定向信息。3文库构建定向将引物附加序列或特殊连接子引入,确保最终测序文库保留原始RNA分子的方向性。这样可以还原转录本的完整结构信息。低投入量建库方法微量RNA投入当样品RNA含量有限时,需要采用特殊的低投入量建库方法,如超低投入的转录组测序技术。这可以实现从极少量样品中得到高质量的测序结果。特殊文库制备对于低投入量的RNA样品,需要使用优化过的文库制备协议,如SMART技术。这可以大幅提升从少量RNA中获得可靠序列数据的能力。单细胞RNA测序当研究对象是极少量的单个细胞时,需要采用专门的单细胞RNA测序技术。这可以对个体细胞的转录组进行深入分析,揭示细胞异质性。核酸修饰检测建库1DNA/RNA修饰测序检测DNA或RNA中的甲基化、羟甲基化等表观遗传学修饰模式。2CHIP-seq/RNA-seq联用通过结合特异性抗体的免疫亲和层析技术与RNA测序，确定基因调控网络。3转录后修饰分析分析mRNA、tRNA、snoRNA等非编码RNA中的腺苷甲基化、假尿嘧啶化等。4单分子检测利用电流信号变化检测DNA/RNA中的5mC、5hmC等修饰碱基。核酸编辑检测建库原理核酸