ASFV结构蛋白p30单克隆抗体制备及与PAM细胞互作蛋白筛选.pdf

摘要

非洲猪瘟（Africanswinefever，ASF）是猪的一种烈性传染病，对猪具有高致病

性和致死率。从2018年疫情在中国暴发至今，ASF对中国的生猪养殖行业产生重大

影响。非洲猪瘟病毒（Africanswinefevervirus，ASFV）的基因组结构十分复杂，目

前对于ASFV的致病机制和宿主对病毒入侵的免疫防御机制了解不够全面，这限制了

疫苗和抗病毒药物的研发。p30蛋白是ASFV感染早期表达的病毒内层囊膜蛋白，具

有良好的免疫原性，参与ASFV入侵细胞的内化过程，但具体作用机制不详。因此，

需要对其进行深入研究，以阐明其在宿主细胞内吞ASFV中的作用机制。本研究从p30

蛋白表达入手，制备了p30蛋白的单克隆抗体（monoclonalantibody，mAb），同时应

用分离的泛素系统介导的酵母双杂交试验来筛选p30蛋白与猪肺泡巨噬细胞（Porcine

alveolarmacrophages，PAM）的互作蛋白。

本研究首先进行了p30蛋白mAb制备及其生物学特性的鉴定。通过原核表达和

Ni柱亲和纯化获得p30蛋白，然后免疫小鼠来制备杂交瘤细胞，利用间接酶联免疫吸

附试验（indirectEnzyme-linkedImmunosorbent，iELISA）和间接免疫荧光试验（indirect

immunofluoresenceassay，IFA）筛选出阳性杂交瘤细胞，并以细胞表达的方式制备

mAb。通过iELISA测定mAb的效价和亚型，通过IFA和蛋白质免疫印迹（WesternBlot）

对mAb特异性进行了鉴定。随后，使用IEDB表位预测软件对p30蛋白的B细胞表

位做出了预测，根据预测结果对CP204L基因进行截短表达，利用IFA、WesternBlot

和iELISA对其B细胞抗原表位进行了初步鉴定。效价测定结果显示mAb的ELISA

效价可达1:512000，mAb亚型鉴定结果表明重链属于IgG2b型，轻链是κ链。特异性

鉴定结果显示该mAb能成功识别ASFV感染PAM细胞中p30蛋白的表达。基因截短

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表达筛选结果表明该mAb识别的B细胞抗原表位区域为M～K。以上结果表明本

研究成功获得p30蛋白的单克隆抗体，该mAb可用于ELISA、IFA和WesternBlot实

验中，为后续实验奠定基础。

由于缺乏针对p30蛋白与PAM细胞互作蛋白的相关研究，本研究以ASFV

GZ201801毒株p30蛋白为诱饵，利用分离泛素介导的酵母双杂交系统进行PAM细胞

cDNA文库筛选，筛选到33个可能与p30蛋白具有相互作用的宿主蛋白。随后从NCBI

上获得候选互作蛋白的基因序列，构建真核表达质粒，进一步通过激光共聚焦、免疫

共沉淀（CO-IP）和GST-Pulldown对筛选结果进行验证。激光共聚焦结果表明PK-15

I

细胞中外源性过表达p30蛋白分别与ARPC5、CAPG、DAB2、OAS1、PARP9、RPSA

和VBP1这7个宿主蛋白存在共定位。CO-IP结果表明293T细胞中外源性过表达p30

蛋白能分别与DAB2、OAS1、PARP9、RPSA、VBP1、CAPG和ARPC5发生免疫共

沉淀，证明p30蛋白与上述蛋白存在相互作用。GST-Pulldown结果表明体外条件下

GST-p30蛋白能下拉DAB2、OAS1、RPSA、PARP9和VBP1蛋白，但不能下拉CAPG

和ARPC5蛋白。说明p30蛋白可以通过与DAB2、OAS1、PARP9、RPSA和VBP1

直接结合发生相互作用，而与CAPG和ARPC5不能直接结合，即p30与CAPG和

ARPC5存在间接相互作用。对上述7个宿主蛋白进行GO功能分析和KEGG通路富

集分析，结果表明这些宿主蛋白主要参与内吞途径、先天免疫应答反应和细胞代谢等

生物学过程。

综上所述，本研究成功制备p30蛋白mAb，并对其基本生物学特性进行了鉴定。

通过酵母双杂交系统筛选，激光共聚焦、CO-IP和GST-Pulldown验证了7个与p30

蛋白具有相互作用的宿主蛋白。这7个蛋白的功能分析结果提示p30蛋白可能在ASFV