微生物实验技术.ppt

负染色：利用电子密度比标本高的重金属盐（如磷钨酸钠、醋酸钠等）将生物标本包围起来，增强背景散射电子的能力以提高反差，在暗的背景下显示标本的形态结构。主要用于颗粒状标本（细菌、病毒、分离的细胞器等）的研究。二、常用的微生物染色法01简单染色法02革兰氏染色法03负染色法细菌的观察方法水浸片（压滴法）：在载玻片中央滴一滴无菌水，再在其中加入少许菌体，使其均匀分布在无菌水中，盖上盖玻片，镜检。01悬滴法：把要观察的含菌液体，滴在盖玻片上，然后把它翻过来，放置在凹孔载玻片上，使液滴悬挂在凹孔室内。02染色法：观察细胞细致形态和主要构造。03涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检简单染色法：只用一种染料处理菌体，适用于一般观察。革兰氏染色法甲菌G+结晶紫碘液乙醇沙黄革兰氏染色法：由丹麦医生C.Gram于1884年创立，其基本操作分为初染、媒染、脱色和复染四个步骤。初染媒染脱色复染乙菌G-通过初染和媒染后，在细菌细胞的膜或原生体上染上了不溶于水的结晶紫与碘的大分子复合物。G+细菌由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧密，在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔因脱水而明显收缩，又由于其基本不含类脂，故在用乙醇处理时不会在壁上溶出缝隙，因此结晶紫与碘复合物仍牢牢阻留在其细胞壁内，呈紫色；G-细菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交联松散，用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔不易收缩，加上其类脂含量高，乙醇把类脂溶解，在细胞壁上出现较大缝隙，结晶紫与碘复合物极易被溶出细胞壁，因此通过乙醇脱色后，细胞呈无色，再经沙黄等染料复染后呈红色。负染色法（荚膜染色法）：用有色背景衬托无色荚膜。三、培养基培养基：一种人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合养料。因此任何培养基都应具备微生物所需的六大营养要素，且其间的比例是合适的。选用和设计培养基的四个原则：目的明确营养协调C/N比=C源中C原子摩尔数/N源中N原子摩尔数经济节约以粗代精，以“野”代“家”，以废代好，以简代繁，以烃代粮，以纤代糖，以氮代朊，以“国”代“进”物理化学条件适宜：pH、渗透压、水活度选用和设计培养基的四个方法：生态模拟、查阅文献、精心设计、试验比较培养对象：四大类微生物所需C源、N源、C/N比、生长因子、pH、渗透压都不同。用途实验室研究：不必过多地计较其成本一般培养用：天然培养基遗传代谢或生理研究：合成培养基发酵生产种子培养基：N源丰富（C/N比低）生产代谢产物含碳的代谢产物：碳源丰富含氮的代谢产物：氮源丰富加入特定元素、特定前体物质pH微生物生长的最适pH值不同。细菌：pH7.0~8.0，放线菌：pH7.5~8.5，酵母菌：pH3.8~6.0，霉菌：pH4.0~5.8微生物生长代谢过程中，会引起培养基pH的变化。糖类发酵、氧化有机酸有机物脂肪水解有机酸培养基内蛋白质脱羧胺类中性成分(NH4)2SO4NH4+选择吸收H2SO4无机盐NaNO3NO3-选择吸收NaOH加磷酸缓冲液内源调节调节加CaCO3或NaHCO3外源调节：按实际需要流加酸液或碱液*：培养基配好后，先用稀酸或稀碱（10%）调pH.渗透压（Osmoticpressure）渗透压：由于溶质浓度差而在细胞膜两侧造成的压力差