表达EnNA4重组柔嫩艾美耳球虫的构建和免疫保护效果研究.pdf

摘要

鸡球虫是严重危害鸡肠道健康的寄生原虫，其中毒害艾美耳球虫（Eimeria

necatrix）是鸡急性小肠球虫病的病原。鸡球虫活卵囊疫苗免疫是目前预防鸡球虫病

的主要手段之一，首次免疫接种后鸡只通过重复摄入疫苗株后代卵囊建立坚强免疫

力，但毒害艾美耳球虫繁殖力较低，且大部分后代卵囊随少量的盲肠粪便排出导致

鸡只摄入不均匀，临床免疫效果欠佳。毒害艾美耳球虫的基因工程疫苗研制为解决

临床免疫效果欠佳问题提供了新方向，但目前主要集中在亚单位疫苗研发，对载体

疫苗研究较少。本研究选择毒害艾美耳球虫疫苗子孢子表面抗原NA4，以繁殖力强、

后代卵囊循环良好的柔嫩艾美耳球虫为表达载体，利用CRISPR/Cas9系统构建重组

柔嫩艾美耳球虫株EtNA4，并进行动物免疫保护试验，评估其免疫效果。

本研究首先通过RT-PCR法获取毒害艾美耳球虫的NA4基因片段，构建重组原

核表达质粒pET28a-NA4，NA4蛋白纯化后经3次免疫鸡只获取NA4抗体的阳性血

清，结果显示，所获得NA4抗体的阳性血清效价为1:12800。

利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，以mCherry红色荧光标签为筛选标记，

构建EtNA4虫株。分别采用多卵囊接种、单卵囊接种和流式分选后接种三种方法进

行连续筛选传代。对后代卵囊进行DNA和RNA水平验证，并以NA4抗体的阳性血

清和his抗体为一抗检测EtNA4目的蛋白表达情况。结果显示，经多卵囊接种和单卵

囊接种的后代卵囊荧光阳性率最高分别为50%和47.9%；连续流式分选5次后获得的

后代卵囊荧光阳性率为30%。EtNA4虫株的DNA、RNA反转录产物均扩增获得阳性

条带。WesternBlot结果显示在25KDa处有特异性目的条带，试验结果表明EtNA4

构建成功并能表达目的蛋白。

对重组虫株EtNA4的繁殖力、致病性及外源蛋白的阶段性表达进行测定。繁殖

力检测试验分为4组，分别感染EtNA4和亲本株，感染剂量为1000个卵囊/羽和1500

个卵囊/羽；致病性检测试验分为3组，分别为EtNA4组、亲本株组和空白对照组，

试验组感染剂量为5000个卵囊/羽；外源蛋白的阶段性表达试验使用3日龄SPF雏

I

鸡，感染剂量为2000个卵囊/羽。繁殖力试验结果表明EtNA4在感染后120h开始有

卵囊排出，早于亲本株的144h，设置不同感染剂量组进行比较，相同感染剂量的

EtNA4的卵囊繁殖能力均明显高于亲本株。致病性试验显示EtNA4组平均记分较亲

本株高，试验结果显示重组株EtNA4相比亲本株致病性增强。试验观察外源蛋白的

阶段性表达结果显示，接种后120h开始逐渐可见红色荧光裂殖体、裂殖子、大配子

和合子。

免疫保护性试验共设置5组，分别为EnW组、EtNA4组、EtmCherry组、非感

染非免疫组和感染非免疫组。试验组从3日龄开始每隔7天对雏鸡进行免疫，共免疫

3次，免疫剂量分别为500，1000和5000个卵囊/羽。免疫后7天进行特异性IgY检

测，并进行两种剂量的毒害艾美耳球虫攻虫试验，高剂量为50000个卵囊/羽，低剂

量为1000个卵囊/羽。期间记录增重情况，攻虫后进行小肠病变记分、卵囊排出情况

等指标的测定。试验结果表明，三次免疫后EtNA4免疫组特异性IgY水平较非免疫

组有显著差异。高剂量组攻虫的病变记分显示各免疫组差异不显著；EnW、EtNA4

和EtmCherry免疫组的相对增重率分别为75.8%、73.4%和76.5%。低剂量攻虫结果

表明3个免疫组卵囊排出率分别减少89.7%、85.0%和78.6%；相对增重率分为85.9%、

92.3%和91.7%。

综上所述，本研究构建并鉴定了表达毒害艾美耳球虫NA4的柔嫩艾美耳球虫株，

EtNA4免疫后有一定的保护力，在毒害艾美耳球虫1000个卵囊/羽攻虫条件下能减少

卵囊排出。本研究为球虫载体疫苗的研制及毒害艾美耳球虫的免疫防控提供了依据。

关键词：毒害艾美耳球虫；柔嫩艾美耳球虫；CRISPR/Cas9；NA4基因；活载体疫

苗

II