茶树转录因子CsHB1的分离及其互作蛋白的初步筛选.pdf

摘要

本课题组前期以茶树咖啡碱合成酶基因yhNMT1启动子PNMT1为诱饵，经酵母单

杂交筛选，从英红9号茶叶cDNA文库中获得N端序列缺失的HD-ZipIV亚家族转

录因子CsHB1。本论文在此基础上，克隆出CsHB1基因cDNA全长，经酵母单杂交

验证其与PNMT1的结合特性，用原核表达体系对其编码蛋白进行了体外表达，借助烟

草细胞测定了其表达蛋白的亚细胞定位，通过酵母双杂交和双分子荧光互补技术分析

了CsHB1与课题组前期获得的咖啡碱合成调控相关蛋白的互作关系，利用烟草瞬时

表达技术分析了CsHB1及其互作蛋白对靶基因的调控特性，通过农杆菌介导的转基

因技术将CsHB1在茶叶愈伤组织进行超表达，测定了CsHB1过表达对组织中yhNMT1

及其互作基因表达的影响。另外，为深入揭示CsHB1在咖啡碱合成代谢中的调控作

用，本论文构建了英红9号茶树cDNA酵母双杂交文库，并通过酵母双杂交从文库中

筛选出CsHB1互作蛋白，利用生物信息学技术对互作蛋白亚细胞定位进行了预测分

析。研究的开展为深入揭示茶树转录因子CsHB1对茶叶咖啡碱合成调控的分子机理

奠定基础。

获得结果主要如下：

（1）CsHB1基因全长的克隆及分析

从英红9号茶树中克隆获得CsHB1基因cDNA全长2172bp，CDS序列推导编码

723个氨基酸，理论等电点为5.82，亲水性总平均值为-0.293。

（2）启动子和转录因子的结合验证

酵母单杂交测定表明，CsHB1转录因子与启动子PNMT1具有结合作用，对茶叶中

其他转录因子CsAN1、CsMYB30、CsWD40、CsMYB251、CsMYB5e、CsGL3同步开

展与启动子PNMT1关系的测定发现，CsAN1转录因子与PNMT1也具有结合作用。

（3）CsHB1原核表达分析与诱导条件优化

将CsHB1通过同源重组构建进原核表达载体pET32a，诱导表达结果表明，当菌

体密度OD600为0.6、加入终浓度1mmol/L诱导剂IPTG、16℃条件下培养6h，可诱

导获得可溶蛋白。

（4）CsHB1与相关转录因子之间的互作分析

通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验结果表明，转录因子CsHB1与咖啡碱合

I

成调控相关转录因子CsWRKY6、CsGBF2具有蛋白互作。另检测发现CsAN1转录因

子与CsWRKY6、CsGBF2无蛋白互作。

（5）CsHB1表达蛋白亚细胞定位分析

通过烟草表达系统进行CsHB1亚细胞定位，发现CsHB1表达蛋白定位于细胞核

和细胞质，与WoLFPOSRT亚细胞定位软件预测结果一致。

（6）转录因子转录活性分析

利用烟草瞬时表达实验测定表明，转录因子CsHB1具有抑制yhNMT1基因表达

的作用，并检测到CsHB1的互作蛋白CsGBF2和CsWRKY6同样具有抑制yhNMT1

基因表达的作用。当将CsHB1分别与其互作蛋白CsGBF2、CsWRKY6组合表达时，

比单个转录因子对yhNMT1基因表达具有更强的抑制作用。

（7）CsHB1在茶叶愈伤组织中过表达的功能分析

将CsHB1基因与pRI101-AN过表达载体连接获得过表达重组载体，通过转基因

获得CsHB1超表达的愈伤组织CsHB1-OE。定量PCR测定分析表明，CsHB1-OE中

yhNMT1基因表达极显著下调，而与CsHB1具有互作的CsGBF2和CsWRKY6基因

表达量均显著上调。

（8）酵母双杂交cDNA文库的构建

以英红九号一芽二叶为材料，提取RNA并经反转录为cDNA，均一化处理后与

载体pGADT7连接并转化大肠杆菌，成功构建出酵母双杂交cDNA文库，库容量为

6.0×10⁷cfu，文库插入片段介于500bp~2000bp之间。

（9）文库中CsHB1互作蛋白的初步筛选