实验五离子交换柱层析法分离氨基酸.ppt

实验六离子交换柱层析法分离氨基酸BA学习采用离子交换树脂分离氨基酸的基本原理。掌握离子交换柱层析法的基本操作技术。目的要求离子交换层析是用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。??即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换反应的过程。一、原理带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。离子交换过程示意：起始吸附解吸完成x+:起始缓冲离子y+：待分离离子z+：待分离离子阳离子交换剂—带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂—带正电荷，与阴离子交换按活性功能基团带电荷性质不同在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即离子交换剂。二、离子交换剂的种类01020304离子交换树脂：主要有聚苯乙烯树脂二乙烯苯苯乙烯+二乙烯苯?聚苯乙烯（单体）（交联剂）交联度=————————×100%05苯乙烯+二乙烯苯按载体种类不同交联度大，网孔变小，大分子量的离子不能进入树脂颗粒内发生离子交换。01在不影响分离的情况下，以采用交联度较高的树脂为好，这样可以提高树脂对离子的选择性。02目数：离子交换树脂的颗粒直径大小Dowex50为20-50目Dowex20840?m297?m100149?m（代表二乙烯苯的百分含量）01树脂resin（据所含交换基团的性质分）02阳离子交换树脂03强酸型含磺酸基团(R-SO3H)04中等酸型含磷酸基团(-O-PO2H4)05弱酸型含酚基、羧基06阴离子交换树脂07强碱含季胺基团[-N+(CH3)3]08弱碱含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)209阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。阴离子交换纤维素—如:DEAE-纤维素pH8.6以下分离中性或酸性物质,具二乙胺乙基阳离子交换纤维素—如:CM-纤维素一般pH4条件下使用,具有羧甲基离子交换纤维素离子交换凝胶—分离大分子物质如：葡聚糖（Sephadex）、聚丙烯酰胺（PAG）、琼脂糖（Sepharose）0102三、操作注意点离子交换剂的选择原则：根据被分离物质的性质选择—同一性质离子交换剂中选用对被分离物质各组分之间结合力差异大的型号交换剂，以保证通过离子交换层析后能得到比较满意的结果。考虑因素：被分离物质带何种电荷被分离物质分子的大小大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素被分离物质所处的环境被分离物质的物理化学性质被分离物质的大概数量根据分离过程的实验条件强酸强碱—应用广泛弱酸型—只能在碱性pH范围内使用弱碱型—只能在酸性pH范围内使用01.02.03.04.缓冲液的选择原则：不能发生化学反应，所带电荷应与样品一致。避免使样品变性原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离子或基团010102030405改变pH或离子强度?增强洗脱液与离子交换剂的结合力?降低分离物与离子交换剂的结合力洗脱方式：梯度洗脱02030405洗脱剂四、应用分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他带电的生物分子离子交换层析法分离氨基酸及测定[原理]所用样品为天冬氨酸和赖氨酸的混合液，分别属酸性氨基酸(pI2.77)、碱性氨基酸(pI9.74)，在缓冲溶液中分别带正电荷和负电荷，与强酸型阳离子交换树脂Dowex50亲和力有很大不同，在一定的洗脱条件下洗脱，将它们分离。利用氨基酸可与茚三酮反应生成有色化合物进行氨基酸鉴定。与水含茚三酮的反应：紫色物质，用于α－氨基酸的比色测定和纸层析显色pH4.2AspLyspH10*