实验四T-A连接(克隆).ppt

****他把不产荚膜的无毒的粗糙型肺炎双球菌和加热杀死后的产荚膜的有毒的光滑型肺炎双球菌混合注射小鼠，发现小鼠意外地被感染致死，而且从小鼠的血液中分离出活的产荚膜的肺炎双球菌。不久又发现产荚膜细菌的无细胞抽提物同样能在试管中使不产荚膜的细菌变为产荚膜的细菌。。*一些载体（如PUC系列质粒）带有β-半乳糖苷酶（lacZ）N端α片段的编码区，该编码区中含有多克隆位点（MCS），可用于构建重组子。这种载体适用于仅编码β-半乳糖苷酶C端ω片段的突变宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有半乳糖苷酶活性，但它们同时存在时，α片段与ω片段可通过α-互补形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地破坏α片段的编码，使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。*一些载体（如PUC系列质粒）带有β-半乳糖苷酶（lacZ）N端α片段的编码区，该编码区中含有多克隆位点（MCS），可用于构建重组子。这种载体适用于仅编码β-半乳糖苷酶C端ω片段的突变宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有半乳糖苷酶活性，但它们同时存在时，α片段与ω片段可通过α-互补形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地破坏α片段的编码，使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。*******欢迎各位老师批评指正！*实验四

T-A连接（克隆）赵建军张龚炜一、实验目的学习和掌握DNA连接的原理和方法理解T-A连接的优缺点理解蓝白斑筛选的原理和方法1DNA连接反应（transformation）利用DNA连接酶把载体DNA和要克隆的目的DNA片段连接在一起，成为一个完整的重组分子。2载体（vector），指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。3T-载体：聚合酶链反应（PCR）产物的克隆载体，两侧3′端各多出一个脱氧胸腺嘧啶核苷酸(T)。由于PCR产物两侧3′端通常含单个脱氧腺嘌呤核苷酸(A)，与T载体之间的A-T互补性可提高PCR产物克隆的效率。二、实验原理二、实验原理二、实验原理自制T载体：XcmI:5’-CCANNNNNˇNNNNTGG-3’二、实验原理一些载体（如PUC系列质粒）带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和N端α片段146个氨基酸的编码信息。该编码区中含有多克隆位点，可用于构建重组子。这种载体适用于仅编码lacZC端ω片段的突变宿主细胞。因此，虽然宿主和质粒编码的片段都没有lacZ活性，但它们同时存在时，α片段与ω片段可通过α-互补形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。二、实验原理而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地破坏α片段的编码，使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。三、T-A连接（克隆）的材料LB平板（Amp抗性）：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl1%，琼脂1.5%，0.5mg/mlAmp。PCR试剂、DNA纯化试剂盒、T载体、DNA连接酶、X-Gal、IPTG。特定的感受态大肠杆菌（DH5a、DH5b、Top10、Bl21等）材料：三、T-A连接（克隆）的材料三、T-A连接（克隆）的材料四、T-A连接（克隆）的过程PCR反应体系(ReactionAssembly)：Component50μLNuclease-freeWater23μL（to50μL）2XPCRMix25μL模板DNA(pC-mChr)1μLPrimerMix1μLMixThoroughlyandSpin.1.克隆DNA片段的准备：PCR反应****他把不产荚膜的无毒的粗糙型肺炎双球菌和加热杀死后的产荚膜的有毒的光滑型肺炎双球菌混合注射小鼠，发现小鼠意外地被感染致死，而且从小鼠的血液