实验三质粒的提取.pptVIP

质粒提取与电泳实验三【实验目的】通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法。【实验原理】碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH值4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此，复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此己完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA分子与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。恒温培养箱01恒温摇床02台式离心机03高压灭菌锅04电泳仪、电泳槽05分光光度仪06凝胶成像系统07【仪器、材料与试剂】仪器葡萄糖01三羟甲基氨基甲烷（Tris）02乙二胺四乙酸(EDTA)03氢氧化钠04十二烷基硫酸钠(SDS)05乙酸钾06冰乙酸07氯仿08材料乙醇胰RNA酶氨苄青霉素蔗糖溴酚蓝酚含pUC19质粒的大肠杆菌吸头、小指管试剂(三)试剂1.溶液I50mmol/L葡萄糖25mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl(pH8.0)10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)2.溶液II0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混合3.溶液III5mol/L乙酸钾60mL冰乙酸11.5mL水28.5mL4.TE缓冲液10mmoL/LTris·HCl(pH8.0)1mmoL/LEDTA(pH8.0)5.70%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回)6.胰RNA酶将RNA酶溶于10mmoL/LTris·HCl(pH7.5)、15mmoL/LNaCl中,配成10mg/mL的浓度,于100℃加热15min,缓慢冷却至室温,保存于-20℃。7.凝胶加样缓冲液（6X）：40%蔗糖、0.25%溴酚兰。将2ml含相应抗生素（Amp：50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入上述的含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。取1.5mL培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中(此处可加5μL浓度为10μg/μLRNaseA处理RNA，在后面TE中就不必加RNaseA),充分混匀，室温放置10min。【实验步骤】加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管盖，混匀内溶物，将离心管放冰上5min。01加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置15min。0212000r/min离心15min，将上清转至另一离心管中。03向上清中加入等体积酚:氯仿（1:1）或氯仿:异戊醇(24:1)（去蛋白），反复混匀，12000r/min离心5min，将上清转移到另一离心管中。04