实验蛋白质含量测定.ppt

紫外吸收法生物化学与分子生物学基础实验管号01234567标准蛋白溶液（ml）01.01.52.02.53.04.00双蒸水（ml）4.03.02.52.01.51.000蛋白质含量(mg/ml)00.250.3750.50.6250.751.0?未知蛋白溶液（ml）-------4.0A280????????????????操作步骤考马斯亮蓝染色法（Bradford法）原理：该方法由Bradford于1976年建立。在酸性条件下，考马斯亮蓝与蛋白质结合后最大光吸收波长由465nm（红色）转移为595nm（蓝色），起作用的主要氨基酸是Arg，另外，His,Lys,Tyr,Trp和Phe也有作用。2－5min呈最大光吸收，至少可稳定1小时简便,迅速，灵敏度较高。只需要一种反应试剂影响因素较少。去污剂和两性物质对测定有干扰小于3000Da的多肽无法测定蛋白浓度高时非线性配制的染色液需过滤除去未溶解的考马斯亮蓝G250考马斯亮蓝染色法（Bradford法）0102考马斯亮蓝染色法（Bradford法）实验操作步骤室温放置5分钟后测595nm的光吸。考马斯亮蓝染料极易吸附于比色皿壁，每次测量后应用乙醇洗涤后，用双蒸水清洗。注意混匀，但不要剧烈震荡。Folin-酚试剂法（Lowry法）原理：Folin-酚试剂法的显色试剂由试剂甲和试剂乙组成。试剂甲中的Cu2+碱性条件下与肽键形成络合物并被还原成Cu+。Cu+以及蛋白质中的Tyr等的侧链基团与试剂乙反应，试剂乙中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的Tyr和Phe残基还原，产生蓝色化合物（钼兰和钨兰的混合物），显色反应在30分钟内接近极限。颜色深浅与蛋白含量成正比，可在640nm下测光吸收。Folin-酚试剂法（Lowry法）不同蛋白质主要因其所含的Tyr含量不同而呈现不同的吸收强度。因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。酸、铜离子螯合剂（如EDTA、柠檬酸等）、还原剂（如巯基乙醇、DTT、苯酚等）干扰本反应。进行测定时，加试剂乙时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当试剂乙加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。费时较长，试剂配制较繁琐。生物化学与分子生物学基础实验实验步骤01234567标准蛋白（1mg/ml）ul02040801201602000待测样品ul-------200蒸馏水ul1000980960920880840800800Folin-酚试剂甲ml44444444混匀，于室温放置10分钟Folin-酚试剂乙ul250250250250250250250250迅速混匀，30℃水浴保温30分钟A640Folin-酚试剂法（Lowry法）试剂、实验材料：

（已放在每个试验台的架子上）Folin-酚试剂甲考马斯亮蓝染色液未知蛋白溶液Folin-酚试剂乙标准蛋白溶液：1mg/mlBSALowry法的改进法。碱性条件下，蛋白分子中的肽键与Cu2+形成络合物，并将Cu2+还原成Cu+；Cu+与BCA结合成紫色复合物，在562nm处吸收值与浓度呈正比BCA法与Lowry方法相比，BCA法的操作更简单，试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度更高（微量检测可达到0.5μg/ml），应用更加灵活。可耐受高达5%的表面活性剂测定不同蛋白样品时比bradford测定法结果均一1BCA法2生物化学与分子生物学基础实验实验一

几种蛋白质定量测定方法的比较实验目的生物化学与分子生物学基础实验掌握分光光度计的原理和使用方法掌握紫外吸收法、Folin－酚试剂法（Lowry法）和考马斯亮蓝染色法（Bradford法）测定蛋白质含量的原理和方法有多少样品可供分析;蛋白质样品浓度大约是多少;样品中含有哪些可能影响定量的化学物质；所选方法是否简单、可靠；含量测定的专一性要求是否很高。选择合适的蛋白质含量测定方法主要基于几点考虑：0102常用的方法生物化学与分子生物学基础实验物理性质