DB22T 3678-2024 普通级实验用猫 金黄色葡萄球菌检测PCR法.docx

ICS65.020.30CCS

ICS

65.020.30

CCS

B44

吉 林 省 地 方 标 准

DB22/T3678—2024

普通级实验用猫金黄色葡萄球菌检测PCR法

DetectionofconventionalexperimentalcatStaphylococcusaureusPCRmethod

2024-12-31发布 2025-02-10实施

吉林省市场监督管理厅 发布

I

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DB22/T3678—2024

前 言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件中的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由吉林省科学技术厅提出并归口。

本文件由吉林省科学技术厅组织实施。本文件标准起草单位：吉林大学。

本文件标准主要起草人：高飞、袁宝、任文陟、刘殿峰、张嘉保、高巍、陈健、胡进平、权福实。

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DB22/T3678—2024

普通级实验用猫金黄色葡萄球菌检测PCR法

范围

本文件描述了普通级实验用猫金黄色葡萄球菌的PCR检测方法，给出了试验原理、材料、样品、试验步骤和结果判定。

本文件适用于普通级实验用猫金黄色葡萄球菌检测。

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

NY/T541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

原理

根据金黄色葡萄球菌nuc基因设计特异性引物进行PCR扩增反应，通过凝胶电泳检测，判定检测结果。

仪器设备

仪器设备包括但不限于：

高速离心机，离心速度：1000r/min～20000r/min；

PCR扩增仪；

电泳仪；

凝胶成像系统；

恒温培养箱，温度：36℃±1℃；

e) 微量移液器（量程：5μL～50μL，50μL～200μL，100μL～1000μL）；

f) 均质器。

材料

材料包括但不限于：

阳性对照品：金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC25923）；

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阴性对照品：无菌水；

7.5%氯化钠营养肉汤，配制方法按A.1配制；

1.5%琼脂糖凝胶，配制方法按A.2配制；

DNA染料；

1%溴酚蓝，配制方法按A.3配制；

50×TAE电泳缓冲液，配制方法按A.4配制；

无RNase去离子水，配制方法按A.5配制；

DNA标准标志物：100bp～2000bp；

70%乙醇溶液（用无RNase去离子水配制）；

核苷酸混合物（dNTPs）。

样品

采集

死亡猫

无菌采集胃、肠道等典型病灶组织或内容物。

用灭菌接种环挑取适量7.1.1.1样品，加入4mL7.5%氯化钠营养肉汤，均质后置于

（36℃±1℃）培养箱中培养18h～24h，取上清液，注明编号后备用。

活体猫

采集中段粪便，干粪便加入7.5%氯化钠营养肉汤均质后进行接种，稀便直接接种培养。置于培养箱中36℃培养18h～24h，取上清液，注明编号后备用。

无菌采集分泌物或浓汁接种在7.5%氯化钠营养肉汤中，置于培养箱中36℃培养18h～

24h，取上清液，注明编号后备用。

存放

采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；如需长期保存，应放置在-80℃冰箱中。

运输

按照NY/T541的规定操作。

8 试验步骤

DNA的提取

采用商品化DNA提取试剂盒，按说明书方法进行操作；或采用等效方法提取。

PCR扩增目的片段

反应体系

PCR反应体系见表 1。上游引物为 5’-GCTTGCTATGATTGTGGTAGCC-3’，下游引物为 5’-CTCTAGCAAGTCCCTTTTCCAC-3’，产物DNA片段长度为423bp，产物基因序列应符合B.1。

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表1 PCR反应体系

试剂

用量/μL

10×Buffer

2.5

dNTP（2.5μmol/L）

0.7

上游引物（20μmol/L）

0.25

下游引物（20μmol/L）

0.25

DNA模板（20ng/μL～50ng/μl）

2.0

TaqE（5U/μL）

0.7

ddH2O（去离子水）

18.6

总体积

25

PCR反应参数

PCR反应参数见表2。

表2 PCR反应参数

序号

步骤

温度/℃

时间

循环数

1

预变