《凝胶过滤层析》课件.pptVIP

*******************凝胶过滤层析凝胶过滤层析是一种常用于分离和纯化蛋白质、核酸等生物大分子的色谱技术。它通过不同大小的生物大分子在填料孔隙中的不同分布而实现分离。凝胶过滤层析的基本原理分子量筛选凝胶过滤层析利用不同分子量的溶质在填料孔隙中的不同扩散能力,从而实现分离。流速控制合理调节流速可以提高分离效果,过快的流速可能导致溶质不能充分分离。样品预处理对样品进行适当的预处理,如溶解、过滤等,可以提高分离的效果和重复性。流动相选择使用合适的缓冲液作为流动相可以维持溶质的稳定性,防止其在层析过程中发生变性。凝胶过滤层析的机理凝胶过滤层析是通过溶质大小与凝胶孔径之间的差异来实现分离的。较大的溶质分子无法进入凝胶孔隙,快速流出柱外,而较小的分子可以进入并在柱内滞留一段时间后再流出。这种机理使得不同大小的溶质分子可以被有效分离。凝胶过滤层析的主要应用分子量测定凝胶过滤层析可以用于测定未知溶质的分子量,通过与标准蛋白质比较分析来实现。蛋白质纯化凝胶过滤层析能够根据分子量大小对蛋白质进行有效分离和纯化。适用于各种复杂的生物大分子样品。核酸分离DNA、RNA和核苷酸等核酸分子也可以通过凝胶过滤层析进行有效分离纯化。小分子化合物分离一些药物、维生素和天然产物等小分子化合物也可应用凝胶过滤层析进行分离与纯化。凝胶过滤层析的优势高分离度凝胶过滤层析可以实现较高的分离度,能够有效分离不同分子量的物质,适用于各种生物大分子的分离纯化。温和条件凝胶过滤层析操作温和,不会导致样品的变性或破坏,能够保证生物活性物质的完整性。简单快速与其他分离技术相比,凝胶过滤层析操作简单,分离过程快捷,对样品的预处理要求也较低。凝胶过滤层析的局限性样品量限制凝胶过滤层析适合处理的样品量有限,不适合大批量样品的处理。分离分辨率有限它无法提供很高的分离分辨率,适用于分子量差异较大的样品。分离过程缓慢凝胶过滤层析的分离速度较慢,不适用于需要快速分离的情况。对溶剂要求高样品需要溶解在与凝胶填料兼容的溶剂中,对溶剂的要求较高。凝胶过滤层析的实验步骤1样品准备对待分离的样品进行溶解、稀释或浓缩等预处理,确保样品性质适合后续层析过程。2柱填料装填选择合适的凝胶填料,将其装填进柱子中,并确保柱床平整紧密。3柱床平衡用流动相冲洗柱床,直至达到稳定的基线。这一步可确保实验条件稳定。4样品上样将预处理好的样品小心地注入柱顶,使其进入柱床开始分离。5流动相洗脱以恒定流速推动流动相通过柱床,使分离的成分逐步洗脱下来。6检测分析在洗脱过程中用检测器实时监测洗脱液的组成变化,记录层析图谱。样品预处理1过滤和离心去除样品中的杂质和固体颗粒,以确保后续分离过程顺利进行。2溶解和稀释将样品溶解或稀释到合适的浓度,以适应柱层析分离的需要。3pH调整根据目标物质的性质,调节样品的pH值,确保其在柱层析过程中保持稳定。4样品溶液浓缩对于痕量样品,可以通过减压浓缩的方式提高样品浓度。柱填料的选择1分子量范围根据待分离溶质的分子量，选择合适的柱填料孔径尺寸。2化学性质考虑溶质的化学特性，选择与之相容的柱填料材质。3稳定性选择对常温、酸碱及有机溶剂等条件较稳定的柱填料。4专一性选择能准确分离目标溶质的专一性柱填料。柱填料的预处理清洗将柱填料充分清洗,去除杂质和细小颗粒,保证柱填料纯净。粒度调整根据实验需要,通过筛分或其他方法,将柱填料粒度调整到合适范围。溶剂交换将柱填料与流动相溶剂混合,预处理以获得良好的亲和性。柱填料填充采用合适的方法将柱填料均匀填充进色谱柱内,避免产生空隙。流动相的选择亲和力根据目标化合物的性质选择合适的流动相，要确保流动相对目标化合物有足够的亲和力。极性化合物需要使用极性流动相，非极性化合物需要使用非极性流动相。分离效果流动相的组成会影响化合物在柱子上的分离度。优化流动相的种类和浓度可以提高目标化合物的分离效果。化学兼容性流动相要与样品溶剂和柱填料化学性质相兼容，避免发生化学反应或者相互作用。溶解度流动相要能充分溶解化合物，确保样品能完全进入柱子并顺利洗脱。层析过程中的注意事项色谱柱管理对色谱柱的装填和保存等过程要格外谨慎,确保其干净、无污染,以保证分离效果。流动相调节流动相的pH值、离子强度、溶剂组成等参数需要精心设置,以优化分离效果。样品注入样品的体积、浓度以及注入方式都会影响层析过程,需要根据实际情况进行调整。流速控制合适的流速有助于提高分离效果,但过快或过慢的流速都可能对分离造成不利影响。层析结果的分析溶质定性分析根据