生化制药基本技术.ppt

四、凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱的分离机理固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；原理：按分子大小分离。凝胶为三维网状结构，可对大小流动产生不同的阻滞作用。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。2.凝胶的种类和性质（1）葡聚糖凝胶商品名为Sephadex，由葡聚糖和环氧氯丙烷在碱性条件下交联而成。主要型号是G-10～G-200。数字是凝胶的吸水量（每克干胶膨胀时吸水的毫升数）的10倍。（2）聚丙烯酰胺凝胶商品名为Bio-gel-P。主要型号有Bio-gel-P-2～Bio-gel-P-300等10种。后面的数字基本代表它们的排阻极限（不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的分子量）的10-3，所以数字越大，可分离的分子量也就越大。（3）琼脂糖凝胶（4）其他多孔玻璃珠和多孔硅胶等。浓缩。利用凝胶颗粒的吸水性可对大分子样品溶液进行浓缩。02脱盐及除去小分子杂质和溶液的浓缩。01分子量测定。在一定范围内，各个组分的洗脱体积Ve与其分子量的对数成线性关系。04生物大分子的纯化及生化药物中热源物质的去除。033.凝胶色谱的应用固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；01流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；02基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；03应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。04五、离子交换色谱六、亲和色谱原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。晶核：在过饱和溶液中，最先析出的微小颗粒就是以后结晶的中心，称为晶核。过饱和溶液饱和溶液一、结晶的原理第四节结晶结晶的过程形成过饱和溶液。晶核的形成。晶体的生长。其中，溶液达到过饱和状态是结晶的前提，过饱和度是结晶的推动力。二、结晶的过程过饱和溶液的形成（1）热饱和溶液冷却适合溶解度随着温度降低而显著减小的情况。（2）部分溶剂蒸发法蒸发法是使溶液加压、常压或减压下加热，蒸发除去部分溶剂达到过饱和的结晶方法。（3）化学反应结晶法通过加入反应剂或调节pH生成一个新的溶解度更低的物质，当其浓度超过它的溶解度时，就结晶析出。（4）盐析法生化制药的基本技术第一节原料的选择、处理及有效成分的提取生化药物的提取与分离方法因原材料、药物的种类和性质不同而存在很大差异。总的来说，其提取纯化一般分为五个步骤：预处理、固液分离、提取、精制和成品加工（包括干燥、制丸、挤压、造粒、制片等步骤），如图所示：生物材料、发酵或培养液↓预处理（清洗、加热、调pH、凝聚、絮凝）↓细胞分离（沉降、离心、过滤）↓细胞↓细胞破碎（高压均质处理、研磨、溶菌处理）↓收集上清液↓初步纯化（沉淀、吸附、萃取、过滤）↓高度纯化（离子交换色谱、亲和色谱、疏水色谱、吸附色谱及电泳等）↓成品加工（无菌过滤、超滤、浓缩、冷冻干燥、喷雾干燥、结晶等）图2-1生化药物提取的一般工艺流程上清液（含胞外产品）选择原则：①有效成分含量高，原料新鲜；原料来源丰富，易得，原料成本低；原料中杂质含量较少等。植物材料确定后，要选择合适的季节、地点、时间后采集并就地去除不用的部分，将有用的部分保鲜处理。保存生物材料的方法主要方法有冷冻法，常用-40℃速冻；有机溶剂脱水法；防腐剂保鲜法。一、原料的选取与保存提取是利用目的物的溶解特性，将其与细胞的固形成分或其它结合成分分离，使其由固相转入液相或从细胞内的生理状态转入特定溶液环境的过程。01许多生化药物具有生物活性，其稳定性受pH、温度、离子强度、金属离子、提取过程中所使用的溶剂等环境因素的影响。02二、生化药物提取1.物理性质与提取（1）对水溶性、盐溶性生物物质的提取可用酸、碱、盐水溶液为提取剂。（2）对水、盐系统无法提取的蛋白质或酶的提取可用表面活性剂或有机溶剂提取，用有机溶剂作为提取试剂时，根据产物存在的状态可分为液-液提取和固-液提取。2.提取的溶剂系统①液-液提取也即萃取，也是利用溶质在互不相溶的两相中分配系数不同而进行的提取分离的方法。杂质溶质原溶液萃取剂Lightphase