琼脂糖凝胶电泳详细过程与步骤.pptVIP

琼脂糖凝胶电泳

Agarosegelelectrophoresis天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉是从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。琼脂糖（agarose）半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷D-半乳糖核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒等大分子物质。透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定样品易回收，常用于制备。琼脂糖凝胶电泳的优点缺点易被细菌污染，不易保存，临用前配制。02机械强度差，易破碎，浓度不能太低。01琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。03与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。04一、实验目的掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。二、实验原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。01溴化乙锭（EthidiumBromide,EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。020102三、实验材料、器具及药品1g琼脂糖加入100ml1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（冷却到60℃，加入100μl的0.5mg/mlEB，并摇匀。）质粒DNA样品。电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。琼脂糖，1XTBE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），6X载样缓冲液四、实验步骤用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。1充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。2用移液器吸取总DNA或质粒样品4μl于封口膜上，再加入2μl的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。3打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。4将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。123MDNA分子的大小双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比；琼脂糖浓度浓度越低，相同核酸分子迁移越快；DNA的构象同一分子：超螺旋环状＞线状＞切口环状010203DNA的迁移速率决定因素凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。所用的电压低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。琼脂糖种类常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；010203不同类型琼脂糖的性质琼脂糖类型凝结温度/℃熔化温度/℃标准琼脂糖35~3890~95不同厂家生产的不同商品其凝结温度和熔化温度有一定差异40~4285~90高强度琼脂糖34~4385~95修饰的低熔点/凝点琼脂糖25~3563~653565超低熔点8~1540~45低黏性低熔点琼脂糖25~307038853075不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围浓度（%）标准(kb)高强度(kb)低熔点(kb)低黏度低溶点(kb)0.31~500.50.7~250.80.5~150.8~100.8~101.00.25~120.4~80.4~81.20.15~60.3~70.3~71.50.08~40.2~40.2~42.00.1~30.1~33.00.05~10.5~14.00.1~0.56.00.01~0.1电泳缓冲液4℃保存备用.常用的电泳缓冲液1TAE的缓冲容量较低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；2