基于双树枝状放大效应的免疫传感器对苯并芘的快速检测.doc

基于双树枝状放大效应的免疫传感器对

苯并芘的快速检测

周摘要：制备了各代聚酰胺-胺(PAMAM)化合物。以反相微乳法制备粒径约为50nm的亚甲基蓝/二氧化硅核壳纳米粒子，并使用硅烷偶联剂3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)对核壳纳米粒子进行改性，使粒子表面氨基化，并对其进行电子透射电镜(TEM)和Zeta电位测试的表征。同时，制备的核壳纳米粒子与高比例的辣根过氧化物酶(HRP)/HRP-标记二抗偶联，从而实现二抗的多标记。接着，在金电极表面电聚合一层三联噻吩导电聚合膜，再通过戊二醛以PAMAM对电极表面的抗原固定位点进行放大。通过PAMAM修饰的电极可以极大地提高抗原分子的固定量。对抗原抗体稀释比、免疫反应孵育时间、检测体系pH值进行优化后，对苯并芘（BaP）进行了抑制竞争检测。

关键词：PAMAM纳米粒子免疫传感器苯并芘

1引言

持久性有机污染物(PersistentOrganicPollutants,POPs)是一类具有长期残留性、生物累积性、半挥发性和高毒性，并通过各种环境介质(大气、水、生物等)能够长距离迁移对人类健康和环境具有严重危害的天然的或人工合成的有机污染物[1]。杀虫剂类POPs作为《斯德哥尔摩公约》首批的12种POPs物质中的绝大多数,也是目前土壤污染的主要污染物之一，做好他们的污染场地的污染控制对于减少POPs污染场地的进一步危害具有实质意义和指导作用[2,3]。目前环境生态系统承载着环境中超痕量的持久性有机污染物这一重要压力，其长期，低剂量暴露下对生物的毒害作用[4]，以及通过食物链放大的生物富集效应是环境化学领域研究的热点，其中，POPs分析检测技术的研究是开展POPs基础性研究的前提和基础。但当今国际上大部分的检测技术的检测限都偏高，且检测费用较高，未能适应我国的国情，无法满足实际环境监测的需求。另一方面，POPs多是小分子，而且在环境样品中的含量极低，这也限制着POPs的分析检测。

免疫传感器的原理是基于抗原抗体的特异性结合，具有选择性好、检测限低、灵敏度高的优点[5]。由于免疫传感器是由高度特异性的抗原抗体作为识别元件，选择性好，灵敏度高，不需要进行样品的预处理，样品中被测组分的分离和检测同时完成。检测一对抗原抗体的相互作用通常用时不到lh。在检测过程中，电极系统将电化学反应直接转换成电信号，可以观察到生物分子间相互作用的结果，可以实现连续、实时、自动化检测分析。所而且近年来与快速发展的微机电技术相结合的微型生物传感器以成本低、易携带、多功能等特点在环境监测领域内异常活跃[6]，具有重要的科学意义和社会经济效益。

多环芳烃苯并芘是极具生物毒性和环境危害的一种POPs[7-8]。本项目以苯并芘作为研究对象构建免疫传感器的研究，利用亚甲基蓝/二氧化硅核壳纳米粒子[9]特殊的优异性能以及PAMAM[10]独具的树枝状结构，分别从传感界面和信号标记两个方面同时进行信号放大，构建了痕量苯并芘检测的免疫传感器，有效地降低了检测限，对POPs的检测起到了积极作用。

2实验部分

2.1试剂和仪器

所有的化学试剂除特别规定的外都为分析纯。多环芳烃抗体(鼠抗)和HRP标记二抗(羊抗鼠)购自SantaCruz，辣根过氧化物酶购自上海博奥，戊二醛，3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，亚甲基蓝(MB)购自百灵威化学试剂有限公司，正硅酸乙酯(TEOS)购自天津市大茂化学试剂厂。2-氨基-5,2:52-三联噻吩由本学院杨卓鸿老师提供。

仪器：磁力搅拌器、高速冷冻离心机、KQ-50B型超声波清洗器、FEI-Tecnai12分析型透射电子显微镜、ZSNanoS马尔文Zata电位分析仪、差热热重仪(DTG-60)、AVATAR360FT-IR型红外光谱仪、Mercury-Plus?300核磁共振波谱仪。电化学实验均在上海辰华CHI660C电化学工作站上进行，采用三电极系统，工作电极为直径2mm的金电极，参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为金属铂电极。

2.2实验步骤

2.2.1PAMAM的制备

氮气保护下，将12g乙二胺和40g甲醇加入到带有磁力搅拌子、回流冷凝管的三口烧瓶中，冰盐浴搅拌条件下，采用滴液漏斗以每秒一滴的速度滴加137.6g丙稀酸甲酯，滴加完成后继续搅拌半小时，撤去冰盐浴，在室温下反应24h。反应完成后在50°C下旋转蒸发，至质量恒重，以除去溶剂甲醇和过量的丙烯酸甲酯。

氮气保护下，将40.4g上述旋蒸产物和64g甲醇加入到有磁力搅拌子、回流冷凝管的三口烧瓶中，室温搅拌条件下，采用滴液漏斗以每秒一滴的速度滴加240g乙二胺，滴加完成后继续搅拌半小时，撤去冰盐浴，反应24h。反应完成后在72°C下旋转蒸发，至质量恒重，以除去溶