生化检验技术基础.ppt

1将待测底物与工具酶保温一定时间后，全部转变成可监测的化合物，然后测定后者的总量来计算待测物的总量或浓度。2尿素＋H2O尿素酶CO2＋2NH33乙醇＋NAD+醇脱氢酶乙醛＋NADH＋H+4反应常呈一级反应。5使待测底物完全转变所需的时间取决于加入的工具酶量。终点法1．代谢物浓度的酶法分析待测物不必完全转变成可监测的化合物，而是利用工具酶反应速率来定量其浓度：一是利用零级反应，如待测物是某个工具酶的激活剂或抑制剂，其浓度可决定该工具酶的反应速度，可采用此方法。因测定时该工具酶本身及其底物都是足量的，故反应为零级反应。动力学法凝血酶-ATⅢ’（无活性）＋残余凝血酶甲苯磺酰-甘-脯-精＋4-硝基苯胺ATⅢ肝素ATⅢ’（ATⅢ’为肝素与ATⅢ复合物）甲苯磺酰-甘-脯-精-4NA凝血酶ATⅢ’＋凝血酶例：测定血清中肝素二是利用一级反应，本法的基本要求是作为某一工具酶底物的待测物的浓度[S]必须远小于该工具酶的Km。此时反应速度基本上与[S]成正比，呈一级反应。动力学法较终点法具有简便、省时、干扰少、可测定低浓度物质、不需样品对照以及易于自动化等优点，成为自动化分析的主要方法。但此法必须同时测定标准样品的反应速度，来推算未知样品中待测物的浓度。这类酶学分析法是用工具酶来测定待测酶的产物以求取待测酶的活性，适合于待测酶产物不能直接监测的情况。01也可有终点法和动力学法两种。022．酶活性测定的酶法分析终点法将底物与待测酶反应一定时间后，终止反应，再用指示酶测定该时间内产物的生成量即可算出酶活性。SExP1EiP2应先将样品与工具酶预保温，使样品中的内源性干扰物充分催化消耗，然后加入底物S起动反应。起动后，因P从零开始升高，故工具酶反应速度也较低，不能代表待测酶反应速度，这一时期称为延滞期。随着反应进行，进入恒态期，只要工具酶用量足够，就能正确地反映酶的活性.02010304（2）偶联反应的基本动力学A延迟期恒态期非恒态期1.51.0SExP1EiP20.50306090120150180秒（以NADH减少为指示反应）如Ei用量过少，Ex的速度Vx大于Ei的速度，即P1生成的速度大于P1消失的速度，可导致P1的逐渐堆积，不能成为恒态或其延滞期极长。但如Ei用量足够，Vi等于或大于Vx，则P1一旦生成可较快或很快转变成P2，P1产生与消失速度一致而成为恒态。Vt×106U/L＝（△A/min）×Vs×L×εA吸光度变化Vt为反应系统总体积Vs为样品体积ε为被测物的摩尔吸光系数(mol-1cm-1)L为光径106是将mol转化成μmol。（四）酶活性浓度的计算合适的底物、辅因子、活化剂、变构剂的种类和浓度01指示酶和辅助酶的种类和浓度02反应混合液的最适pH，缓冲液种类和浓度03去除各种抑制剂04酶活性测定的最适条件酶促反应的两个阶段反应级数0级1级1.可逆反应产物抑制酶变性失活v=dP/dt4.底物不饱和时间t酶反应进程和酶浓度曲线酶量[E]401.[E]越大，线性反产应期越短物2.[E]相同，[S]越小，[P]20线性反应期越短105