生化分离工程实验.ppt

系统His-Tag系统pMAL系统操作步骤Elutionbuffer洗涤2次buffer+10mM麦芽糖的溶液洗涤2次加入20%乙醇保存加入20%乙醇保存后续反应酶切去除标签注：收集到的蛋白做好标记后须在冰上保存，避免其失活pMAL?系统MBP标签的切除从A595最大的几管(一般是第一、二管)取100μl用于蛋白酶FactorXa的酶解，在100μl洗脱液中取15ul保存在pcr管中，作为酶切对照，剩下的加入2ul的FactorXa后置于摇床上震荡反应，室温下反应18h，分别于第1h、3h、6h、17h取样15μl。*左图所示的就是组氨酸，组氨酸是具有杂环的氨基酸，具有一个咪唑基团。组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段,在刚刚提到pET28a载体上就具有这个标签，这个标签在PH8.0时不带电,且无免疫原性,对蛋白质的分泌,折叠,功能基本上无影响.能高度亲和镍离子,用于蛋白质的亲和纯化。右图所示的是Ni2+等过渡金属离子与次氮基三乙酸（Nitrilotriaceticacid，NTA）形成螯合金属盐，这种螯合的金属盐可以固定在固定相粒子表面，用做亲和吸附蛋白质的配基。*这幅图基本表示了组氨酸标签与Ni-NTA的亲和作用的机理，从图中可以看出螯合的金属盐可以固定在固定相粒子表面，用做亲和吸附蛋白质的配基。带有组氨酸标签蛋白因此有了咪唑基团，咪唑基团的化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，在亲和层析中，利用这个原理进行吸附，亲和配体（也就是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。*我们看一下带组氨酸标签的蛋白与Ni-NTA的亲和纯化的步骤重组质粒首先在细胞内表达，得到了带有组氨酸标签的目的蛋白。一般情况下在细胞进行破碎之后，在上清中的蛋白质是具有天然构象未变性的融合蛋白，而在沉淀中存在的就是我们经常提到的包涵体蛋白，通常是变性的蛋白质，因此需要用尿素使其溶解，然后将处理好的镍柱用含有咪唑的缓冲液进行平衡，因为咪唑与带有组氨酸标签的蛋白与Ni离子的结合是竞争机制，因此这时的缓冲液咪唑浓度较低，然后将含有目的蛋白和一些杂蛋白的样品过柱，镍柱中的镍离子吸附带有组氨酸标签的目的蛋白，而在杂蛋白中可能存在带有杂环的色氨酸、半胱氨酸残基的蛋白质，也有可能被吸附，因此要用咪唑浓度比较高的缓冲液进行杂蛋白的洗脱，也就是图上所示的Wash的过程。将杂蛋白洗净后，再用含有高浓度咪唑的缓冲液进行目的蛋白洗脱，也就是Elute的过程，得到的就是纯化出来的目的蛋白。在实际的应用中，我们应该尽量优化条件，特别要掌握好Bind,wash,elute过程中所用缓冲液的咪唑的浓度。以便于得到纯度较高的蛋白质。生化分离工程实验指导老师：何进教授电子邮箱：联系电话：赵有文01刘舒02胡轶敏03危雅乐04助教学生：1组李佳佳（组长）董奇峰吴婷婷杨后召2组范文瑾（组长）谢贻天熊雅琪罗文3组刘小翠（组长）张箐郑琦孟庆4组罗云超（组长）刘浩宇黄玮李智5组唐清（组长）李斌严楠峰柴芝培6组白腾龙（组长）伍良伟余乐裴媛筠7组邹铮铮（组长）刘娟尹学琳王海云8组赵鹏（组长）张灵芬潘丽娜余晓岚菌株的优化培养总DNA或RNA的抽提PCR或RT-PCR扩增目的基因乙醇沉淀回收线性化片断大肠杆菌表达载体pET-28酶连产物转化E.coliDH5?挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒(PCR及酶切验证)检索感兴趣的基因（hfq/fabz）直接优化并合成连T载测序重组表达质粒转化E.coliBL21挑取重组子,用菌落PCR方法验证IPTG诱导促使目的大量蛋白表达细胞破碎及蛋白抽提目标蛋白的纯化蛋白质浓度测定--Bradford法目标蛋白的鉴定—Westernbiotting结晶结构解析本次试验内容His-Tag系统01pMAL系统02无细胞体系03本次试验的主要内容目的基因的背景资料HfqfabZHfq是一个高度保守的RNA结合蛋白，最初被发现是作为大肠杆菌RNA噬菌体Qβ复制所必需的管家因子。现在则被认为是细菌基因转录后调控的关键因子，广泛参与细菌多种生命活动的调控。大肠杆菌fabZ基因编码3-羟基脂酰ACP脱水酶，是大肠杆菌中的必须基因，该基因的突变会导致细菌细胞的死亡。生化分离工程实验（星期五）一，接种按1%的接种量将两种菌株分别加入到含抗生素的LB培养基中,做好标记（写清组号，菌株信息、抗性），统一放于第八组台面。系统