生化实验技术讲座.ppt

电泳的分类原则上按电泳的原理来分，可分为二类：自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。引言按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。引言淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质第一节电泳的基本原理电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的。若将带净电荷Q的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为：F引=EQ（1）在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力F阻F阻=6πrηV当F引=F阻时EQ=6πrηVV=由上式可以看出,粒子的移动速度(泳动速度V)与电场强度(E)和粒子所带电荷量(Q)成正比,而与粒子的半径(r)及溶液的粘度(η)成反比。非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更大的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有关。EQ6πrη（2）（3）（4）电泳的基本原理在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。01+02由（4）可知，带电粒子的泳动速度受电场强度影响，使得同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同，为了便于比较，常用迁移率m（或称泳动度，指带电粒子在单位电场强度下的泳动速度）代替泳动速度表示粒子的泳动情况。m=V/E=Q/6πrη（5）由上式可以看出，迁移率仅与球形粒子所带电荷数量，粒子大小及溶液粘度有关而与电场强度无关。6πrηEQV=电泳的基本原理由于蛋白质、氨基酸等的电离度α随溶液pH变化而不同，所以实际上常使用有效迁移率。有效迁移率U为迁移率m和当时条件下电离度α的乘积。U=mα（6）将（6）式代入（5）式得：U=（7）.Qα.6πrη由（7）式可以看出，凡能影响溶液粘度η的因素如温度，影响分子带电量Q及解离度α的因素如pH的改变，都会对有效迁移率，产生影响。生物化学实验技术理论讲座工欲善其事，必先利其器天津科技大学生物技术系刘常金200712第一部分色谱技术层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography)。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。1944年出现纸层析。以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。层析法的基本原理层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。12543按层析过程的机理分类：吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性