生化与分子生物学技术原理.ppt

Ns~dNs~NmNs~Nt~dNt?Base与Ns吸收值差异大?稀有成分的吸收光谱特征常不同于常见成分?一般λmax250-280,λmin220-250?Gua类在酸性时,UV下兰色荧光,光谱曲线有 肩。吸收曲线特征与pH相关,pH1,7,12下测定。注意点:细胞中的核酸第二章核酸的分离纯化一.细胞中的核酸1.存在状态与蛋白质结合(除tRNA)2.分布DNA:原核核质区真核95%核内 5%核外（mt,ct)RNA:原核胞质真核90%质(15%细胞器）10%核含量01少,细胞干重5-15%,10ˉ15-10ˉ10g/cell大小02RNA104-106DaDNA＞106Da制备中注意事项保持生物学功能,具有生物活性分子完整,天然状态(未变性)简化步骤避免高温0-4℃避免过酸或过碱pH5-9防止机械剪切作用（shearing)防止核酸酶降解作用5.防止核酸酶降解作用a.DNase活性需要Me2+(Mg2+,Ca2+,Mn2+……)螯合剂?SSC柠檬酸三钠-NaCl?EDTA-Na2乙二胺四乙酸钠(Me2+)?EGTA乙二醇二氨基乙醚四乙酸 (Ca2+特异性)b.RNase活性不需Me2+，热稳定，回复能力强.●防止外源RNase污染污染源：器皿、溶液、操作者．措施?180℃高温处理数小时?0.1%DEPC（二乙基焦碳酸盐)处理OO蛋白变性剂 C2H5–O–C–O–C–O–C2H5共价修饰RNase?操作者●抑制内源RNase尽早、彻底去蛋白?非专一性吸附剂RNase碱性蛋白（pI9.6）,中性pH下 静电吸附．皂土、复合硅酸盐（Macaloid）、多聚阴 离子（肝素、聚乙烯硫酸酯）．?蛋白变性剂异硫氰酸胍、SDS（十二烷基硫酸钠）破细胞同时使RNase失活?RNase抑制剂RNasin465aa酸性蛋白（鼠肝、人胎盘）与RNase结合，保护RNA,不用于提取．?核苷酸底物类似物–—竞争性抑制剂ApUpRNaseAG2’-5’GRNaseT1总核酸目的核酸细胞器目的核酸核酸的分离提取?物理法石英沙研磨、超声、匀浆、捣碎器．?化学法去污剂、蛋白变性剂破膜?生化法溶菌酶、蛋白酶动、植物材料液N2,机械破碎细菌溶菌酶水解肽聚糖破壁培养细胞去污剂与蛋白酶破膜破细胞破膜用去污剂?SDSC12-H25-O-SO3Na＋0.5-2%终浓度[Na+]≧1MSDS↓影响CsCl梯度?Sarkosyl（十二烷基肌氨酸钠）3%终浓度?异硫氰酸胍?非离子型去污剂TritonX-100、Brij58作用温和、膜部 分破2．解聚核蛋白并除蛋白a.去污剂核酸pI2-2.5SDS结合蛋白质浓KAc+SDS→SDS-K↓酚、氯仿蛋白质变性剂酚、酚／氯仿－异戊醇、氯仿－异戊醇注意：防剪切力（振荡速度、大口吸管），处理酚（重蒸、缓冲液饱和、0.1%a．乙醇核酸的Na,K盐在乙醇中↓有机溶剂核酸的沉淀8-羟基喹啉）ProteinaseK处理广谱,水解力强,可在SDS,EDTA存在下作用．?调节盐浓度：0.1MNaCl,0.3MNaAc,2.5MNH4Ac?加2-2.5V冷乙醇（﹥95%）搅出DNA或离心↓?70-75%乙醇洗涤去盐除尽EtOH,干燥?溶于TE(10mMT