生物工程下游技术第十四章+电泳分离技术.ppt

03样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.702(A为正面,B为剖面)01图1聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图04分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3架膜加盖接导线，开机3.醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白电泳仪器浸泡将醋酸纤维素薄膜在缓冲溶液中浸泡20min，取出识别光面和麻面。点样用镊子将薄膜置于滤纸上，吸收多余的液体，用铅笔在薄膜麻面一端2cm处画一细线，利用载玻片一侧蘸取样品，于细线处点样。电泳将薄膜麻面朝下，平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，点样一端靠近负极；通电后先使U=80V，待10min后，使U=120V电泳40min。染色将薄膜取出后，置于氨基黑10B染色剂重染色10min。漂洗将薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，至无蛋白区无蓝黑色。实验操作：4.等电聚焦(IsoelectrofocusingIEForEF)原理Pr为两性电解质，不同Pr其aa的数量、种类及占比例不同，因此pI不同，pI范围窄且净电荷为零，因此依pI分离Pr。EF是在凝胶中加两性载体电解质，通直流电后，可形成从阳极到阴极逐步增加的pH梯度(连续的、稳定的、线性的pH)。当Pr在电场中迁移到它的PI时，由于净电荷为零，不再移动。如扩散，附近的凝胶会使其荷电，阳、阴极会重新吸引它回到pI位置。因此Pr只能在pI位置被浓缩成窄、稳定的带。称这种浓缩效应为聚焦。只要凝胶中的pH梯度范围足够窄。便可将pI相近的Pr分开，EF是电泳技术中分辨率最高的技术。原理（续）方法（EF的关键）载体两性电解质CA分辨率0.01pH固相pH梯度以具弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物CH2＝CH─CO─NH─RR=─COOHR=─4级氨基R为弱酸or弱碱,形成缓冲体系****第十四章电泳分离技术1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法，并于1948年荣获诺贝尔奖。70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：提高分辨率及灵敏度。简化操作，缩短电泳时间。扩大应用范围。各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。前言1.电泳技术的基本原理电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。u:泳动度or泳动率(cm/伏·秒or分)V:泳动速度:cm/秒or分E:电场强度:伏特/cmd:泳动距离:cmt:电泳时间:秒/分U:电压:常压(100—500v)高压(500—10000v)仅需几分钟l:支持场的长度(有效长度)(1)泳动度u(迁移率):带电质点在单位强度电场下的泳动速度不同分子在同一电场中可能具有不同的泳动度(2)影响泳动率u的因素内因：1.净电荷2.质点大小3.质点形状外因：1.V(U/L)2.缓冲液的pH(pH恒定)3.离子强度[I]最适:0.02-0.24.电渗：液体对固体支持物的相对移动电泳类型载体电泳纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳包括：垂直板、盘状、等电聚焦、梯度、免疫电泳自由界面电泳支持物为溶液，很少用。2.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP)或核黄素(C17H2O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。■凝胶的聚合反应：Ammoniumpersulfate(freeradicalinitiator)过硫酸铵Acrylamide(monomer)Bis(acrylamide)(bridge)TEMED(catalyst):四甲基乙二胺自由基的生成者凝胶的基本單位:丙烯酰胺交联使聚合产生分枝:甲叉丙烯酰胺帮助传递自由基的加速剂Acrylamide有毒性！-(OS-SO)442-2SO4CH2=CH-CO-NH212112核黄素-TEMED系统与过硫酸铵-TEMED系统■丙烯酰胺单体聚合过程：聚合反应交联剂造成分枝端点自由基可再延续freeradicalBis