牙鲆抗迟缓爱德华氏菌感染相关的3个基因鉴定及功能验证.pdf

第三章牙鲆sh2b3基因的克隆及在免疫应答反应中的表达模式初步分析33

1引言33

2材料与方法34

2.1实验材料34

2.2实验方法34

3实验结果37

3.1Posh2b3基因序列37

3.2Posh2b3基因的进化分析39

3.3Posh2b3基因SNP位点与抗病力的关联分析41

3.4Posh2b3基因的表达模式42

4讨论46

5小结48

第四章牙鲆epg5基因的克隆及在免疫应答反应中的表达模式初步分析49

1引言49

2材料与方法50

2.1实验材料50

2.2实验方法50

3实验结果53

3.1Poepg5基因序列53

3.2Poepg5基因的进化分析54

3.3Poepg5基因SNP位点与抗病力的关联分析57

3.4Poepg5基因的表达模式58

4讨论62

5小结63

第五章牙鲆抗迟缓爱德华氏菌家系和易感家系肝脏microRNA测序分析65

1引言65

2材料与方法65

2.1实验材料65

2.2实验方法66

3结果67

3.1microRNA鉴定67

3.2差异miRNA分析68

3.3miRNA靶向基因预测70

3.4差异miRNA靶基因的富集化分析71

4讨论75

5小结76

结论77

参考文献79

致谢87

攻读学位期间取得的成果和荣誉89

牙鲆抗迟缓爱德华氏菌感染相关的3个基因鉴定及功

能验证

摘要

牙鲆作为一种近海冷温底栖鲆鲽鱼类，营养价值高、生长速度快、适合工厂

化养殖模式、经济效益高，是我国北方海水鱼类养殖业的重要经济品种。但随着

养殖规模扩大，长期的高密度养殖造成牙鲆种质退化，成活率变低，生长速度变

慢，抗病能力降低，养殖过程中病害频发。其中迟缓爱德华氏菌感染造成的腹水

病是牙鲆养殖过程中的高发细菌病，严重阻碍我国牙鲆养殖产业发展。研究牙鲆

抗细菌病相关基因，发掘分子标记用于辅助育种，构建高抗病力的优良牙鲆家系

是解决牙鲆病害问题的有效方法之一。本论文以牙鲆为研究对象，在实验室前期

GWAS筛选得到牙鲆抗迟缓爱德华氏菌相关基因的基础上，对免疫相关基因进

行克隆鉴定和免疫功能研究，并对牙鲆抗迟缓爱德华氏菌感染家系和易感家系肝

microRNA进行测序分析，筛选影响牙鲆家系抗病力的相关microRNA及基因，

为解析牙鲆抗迟缓爱德华氏菌感染机制提供理论基础。

1.牙鲆rnd1基因克隆、表达模式及与抗病力的关系

为探索牙鲆rnd1基因在牙鲆免疫应答反应中的作用，分析该基因与牙鲆抗

病力的关系，本实验对Pornd1基因进行克隆鉴定和抗病相关SNP位点的定位，

结果显示，Pornd1cDNA开放阅读框为699bp，编码232个氨基酸，确定Pornd1

基因内含子2上存在一个抗迟缓爱德华氏菌病相关SNP，该位点在易感家系和

抗病家系中分别是C/T。利用实时荧光定量PCR对Pornd1基因的组织分布、细

菌感染后表达情况以及在抗病和易感家系中的表达水平进行检测，结果显示，

Pornd1在心、肝、肾中的相对表达量较高；迟缓爱德华氏菌感染后肝、肾、脾中

Pornd1的表达量在6h降低后逐渐升高，在48h达到最高。Pornd1在抗病家系

肝脏中的表达量显著高于易感家系。本实验在蛋白水平，利用大肠杆菌表达系统

表达PoRnd1重组蛋白，检测其抑菌活性。结果显示，PoRnd1重组蛋白对金黄葡

萄球菌、大肠杆菌、迟缓爱德华氏菌和哈维氏弧菌均具有一定抑菌活性，揭示了

Pornd1在牙鲆免疫抗病方面的作用，为系统解析牙鲆抗病性状遗传机制提供基

础资料。

2.牙鲆sh2b3、epg5基因克隆及其在免疫应答中表达模式初步分析

为分