2025年植物病原真菌的分离培养 .pdfVIP

不飞则已，一飞冲天；不鸣则已，一鸣惊人。——《韩非子》

植物病原真菌的分离培养

实验⼗三植物病原真菌的分离培养

⼀、实验原理

植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，⼀般都能恢复⽣长和繁殖。植物病原菌的分离就是

指通过⼈⼯培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环

境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。植物病原真菌的分离⼀般都是采⽤组织分离法，就是切取⼩块病组织，经表⾯

消毒和灭菌⽔洗过后，移到⼈⼯培养基上培养。

⼆、实验⽬的：

植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之⼀，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等⽅

⾯都是经常使⽤的研究⼿段。通过本实验，要求植物病原菌分离培养的⼀般原则和⽅法。

三、实验材料及准备：

1．分离材料：梨⿊斑病（Alternariakikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotiasp）及杉⽊炭疽病（Glomerellacingolata）新发

病的病叶；杨树烂⽪病（Cytosporachrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorellasp.）的带有新病斑的枝条；油松种⼦。

2．分离⽤具（每⼩组为单位）

酒精灯4个，⼿术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养⽫（Φ9cm）24套，⼩烧杯（5ml）4个，⼤烧杯1个，斜⾯培养基

12管，灭菌⽔4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）0.1%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，⽕柴1盒，湿、⼲纱布各4

张。

四、实验⽅法及步骤：

（⼀）、分离前的准备⼯作：

1．⼯作环境的清洁和消毒

分离培养⼀般在⽆菌室、⽆菌箱或⽆菌⼯作台（超净⼯作台）上进⾏，⽆菌室和⽆菌箱要经过喷雾除尘，并⽤药物或紫外线照

射消毒（常⽤消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%⽯炭酸液等喷雾。若⽤紫外线灯照射则需20-30分钟）。在没有上述设

备条件时，在清洁房间⾥关闭门窗，避免空⽓流动，经过喷雾除去空⽓及地⾯灰尘后进⾏操作，也可获得较好的结果。⼯作前

擦净桌⾯，最好铺上湿纱布。将所需⽤的物品按次序放在⼯作台上，避免⼯作时⾛动，⼯作⼈员最好穿上灭菌后的⼯作服，带

上⼝罩，并⽤肥皂洗⼿，⽤70%酒精或0.1%新洁尔灭擦⼿。

2．分离⽤具的消毒

凡是和分离材料接触的器⽫（⼑、剪、镊、针等）都要随时（⾄少在使⽤时）保持⽆菌，将这些⽤具浸于70%酒精中，使⽤时

在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3次（⼑、剪、镊等不宜在灯焰上烧时过长，以防退⽕）。再次使⽤时必须重复灭菌。培养

⽫、试验等要

经过⼲热灭菌。培养基及洗涤或稀释⽤蒸馏⽔都需要事先经过⾼压蒸⽓灭菌。

3．分离材料的选择

⽤新发病的植株、器官或组织做为分离材料，可以减少腐⽣菌的污染。任何植物坏死部分的内部或表⾯，都可能有腐⽣微⽣物

的孽⽣，所以⼀般斑点病害应从邻近健全组织，即从病、健组织交界处获得分离材料。

（⼆）、植物病原菌的分离

1．叶斑类和枝杆病斑类（⾮维管束侵染）病原菌分离：

⾸先选择具有典型症状的新鲜病叶作为分离材料，按下述步骤操作：

①培养基平板制备：将PDA培养基在微波炉中加热熔化验，以⽆菌操作法将溶化过的培养基倾注⼊灭过菌的培养基中，每⽫经

12毫升，可形成2-3毫⽶厚的平板。（为防⽌细菌污染，倒碟前给每三⾓瓶内加6%乳酸4-6滴）。

②病叶或病枝经⾃来⽔冲洗，从病斑周转1-2毫⽶处的健组织部位剪下（若为枝⼲，则将带有病斑的⽪层剥下，但）。

③取10毫升⼩烧杯经酒带消毒，放⼊分离材料，倒⼊0.1%升汞液适量作表⾯消毒⼀分钟，或⽤1%漂⽩粉消毒均可。

④消毒后倾出消毒液，⽤⽆菌⽔冲洗2——3，最后⼀次⽆菌⽔不要倒掉。

饭疏食，饮水，曲肱而枕之，乐亦在其中矣。不义而富且贵，于我如浮云。——《论语》

⑤⽤灭菌镊，剪在⽆菌⽔中将分离材料剪成2——3毫⽶⼤⼩的⽅块，每块组织均应为病健相间组织。⽤灭菌镊⼦夹取剪好的材

料，放⼊培养基平板上，轻轻按压。每⽫4——5块，排放均匀。

⑥⽤蜡笔在培养⽫上注明分离代号，⽇期、姓名，将培养⽫翻转放置于23—25℃

⑦3——4⽇后挑选由分离材料上长出的典型⽽⽆杂菌的菌落，在菌落边缘⽤移菌针挑取带有菌丝的培养基⼀⼩块，转⼊试管斜

⾯培养基中央，于25℃温箱中培养。

2．种⼦内病菌的分离：

将整粒种⼦或种⼦的⼀部分进⾏冲洗，再经表⾯消毒（升汞或漂⽩粉），最后⽤灭菌⽔洗涤后移到⼈⼯培养基平板上培养（或

者直接放在⽫内保湿培养于25℃温箱中）。

3．为害输导组织病原的分离（以枯萎病为代表）

先将分离茎作表⾯消毒，然后⽤灭菌⼑剥去表⽪，剪取其中⼩块变⾊