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2025年植物病原真菌的分离培养 .pdfVIP

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不飞则已,一飞冲天;不鸣则已,一鸣惊人。——《韩非子》

植物病原真菌的分离培养

实验⼗三植物病原真菌的分离培养

⼀、实验原理

植物患病组织内的真菌菌丝体,如果给予适宜的环境条件,除个别种类外,⼀般都能恢复⽣长和繁殖。植物病原菌的分离就是

指通过⼈⼯培养,从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开,并从寄主植物中分离出来,再将分离到的病原菌于适宜环

境内纯化,这个过程总称植物病菌的分离培养。植物病原真菌的分离⼀般都是采⽤组织分离法,就是切取⼩块病组织,经表⾯

消毒和灭菌⽔洗过后,移到⼈⼯培养基上培养。

⼆、实验⽬的:

植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之⼀,它对原害鉴定,病原形态观察、植物病害接种体的培养等⽅

⾯都是经常使⽤的研究⼿段。通过本实验,要求植物病原菌分离培养的⼀般原则和⽅法。

三、实验材料及准备:

1.分离材料:梨⿊斑病(Alternariakikuchiana),柿树圆斑病(Pestnlotiasp)及杉⽊炭疽病(Glomerellacingolata)新发

病的病叶;杨树烂⽪病(Cytosporachrysosperma)国槐腐烂病(Dothiorellasp.)的带有新病斑的枝条;油松种⼦。

2.分离⽤具(每⼩组为单位)

酒精灯4个,⼿术剪4把,眼科镊4把,PDA培养基3瓶,培养⽫(Φ9cm)24套,⼩烧杯(5ml)4个,⼤烧杯1个,斜⾯培养基

12管,灭菌⽔4瓶,75%酒精瓶1个(内放脱脂棉球)0.1%升汞瓶1个,5%乳酸瓶(60ml)1个,⽕柴1盒,湿、⼲纱布各4

张。

四、实验⽅法及步骤:

(⼀)、分离前的准备⼯作:

1.⼯作环境的清洁和消毒

分离培养⼀般在⽆菌室、⽆菌箱或⽆菌⼯作台(超净⼯作台)上进⾏,⽆菌室和⽆菌箱要经过喷雾除尘,并⽤药物或紫外线照

射消毒(常⽤消毒药物为70%酒精,2%煤酚皂液,5%⽯炭酸液等喷雾。若⽤紫外线灯照射则需20-30分钟)。在没有上述设

备条件时,在清洁房间⾥关闭门窗,避免空⽓流动,经过喷雾除去空⽓及地⾯灰尘后进⾏操作,也可获得较好的结果。⼯作前

擦净桌⾯,最好铺上湿纱布。将所需⽤的物品按次序放在⼯作台上,避免⼯作时⾛动,⼯作⼈员最好穿上灭菌后的⼯作服,带

上⼝罩,并⽤肥皂洗⼿,⽤70%酒精或0.1%新洁尔灭擦⼿。

2.分离⽤具的消毒

凡是和分离材料接触的器⽫(⼑、剪、镊、针等)都要随时(⾄少在使⽤时)保持⽆菌,将这些⽤具浸于70%酒精中,使⽤时

在灯焰上灭菌烧去酒精,如此2-3次(⼑、剪、镊等不宜在灯焰上烧时过长,以防退⽕)。再次使⽤时必须重复灭菌。培养

⽫、试验等要

经过⼲热灭菌。培养基及洗涤或稀释⽤蒸馏⽔都需要事先经过⾼压蒸⽓灭菌。

3.分离材料的选择

⽤新发病的植株、器官或组织做为分离材料,可以减少腐⽣菌的污染。任何植物坏死部分的内部或表⾯,都可能有腐⽣微⽣物

的孽⽣,所以⼀般斑点病害应从邻近健全组织,即从病、健组织交界处获得分离材料。

(⼆)、植物病原菌的分离

1.叶斑类和枝杆病斑类(⾮维管束侵染)病原菌分离:

⾸先选择具有典型症状的新鲜病叶作为分离材料,按下述步骤操作:

①培养基平板制备:将PDA培养基在微波炉中加热熔化验,以⽆菌操作法将溶化过的培养基倾注⼊灭过菌的培养基中,每⽫经

12毫升,可形成2-3毫⽶厚的平板。(为防⽌细菌污染,倒碟前给每三⾓瓶内加6%乳酸4-6滴)。

②病叶或病枝经⾃来⽔冲洗,从病斑周转1-2毫⽶处的健组织部位剪下(若为枝⼲,则将带有病斑的⽪层剥下,但)。

③取10毫升⼩烧杯经酒带消毒,放⼊分离材料,倒⼊0.1%升汞液适量作表⾯消毒⼀分钟,或⽤1%漂⽩粉消毒均可。

④消毒后倾出消毒液,⽤⽆菌⽔冲洗2——3,最后⼀次⽆菌⽔不要倒掉。

饭疏食,饮水,曲肱而枕之,乐亦在其中矣。不义而富且贵,于我如浮云。——《论语》

⑤⽤灭菌镊,剪在⽆菌⽔中将分离材料剪成2——3毫⽶⼤⼩的⽅块,每块组织均应为病健相间组织。⽤灭菌镊⼦夹取剪好的材

料,放⼊培养基平板上,轻轻按压。每⽫4——5块,排放均匀。

⑥⽤蜡笔在培养⽫上注明分离代号,⽇期、姓名,将培养⽫翻转放置于23—25℃

⑦3——4⽇后挑选由分离材料上长出的典型⽽⽆杂菌的菌落,在菌落边缘⽤移菌针挑取带有菌丝的培养基⼀⼩块,转⼊试管斜

⾯培养基中央,于25℃温箱中培养。

2.种⼦内病菌的分离:

将整粒种⼦或种⼦的⼀部分进⾏冲洗,再经表⾯消毒(升汞或漂⽩粉),最后⽤灭菌⽔洗涤后移到⼈⼯培养基平板上培养(或

者直接放在⽫内保湿培养于25℃温箱中)。

3.为害输导组织病原的分离(以枯萎病为代表)

先将分离茎作表⾯消毒,然后⽤灭菌⼑剥去表⽪,剪取其中⼩块变⾊

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