生物样品前处理.ppt

Anychromatographyseparationwillbeacompromisebetweenspeed,capacity,resolutionandrecovery.Thenextfewslidesshowtheshiftinfocuswithrespecttotheseparameters,duringapurificationprocedure.Foragooddescriptionofthisandthenexttwoslides:seeIonExchangeChromatography-PrinciplesandMethods,codeno18-1114-21ed.AA,p.109-112.Normalemntelosprocesosdepurificaciónempiezancongrandesvolumenesprocedentesdeextractoscrudosocultivoscellulares.Rapidez:ParareduciralmáximoeltiempodeaplicacióndelamuestrayevitarproteolisisuotrosefectosdestructivosCapacidad:Escogerungeldealtacapacidadnospermitirareduciralmáximola“escala”deequipamientoquenecesitamosSacrificamosresolución.现代生化分离技术SeparationMethodsinBiochemistry*第二章生物样品前处理第二章生物样品前处理第一章绪论*第二章生物样品前处理01.第一节样品分离的预提取02.第二节细胞的破碎与分离第一节样品分离的预提取（前处理）*第二章生物样品前处理动物细胞反应液植物细胞反应液微生物细胞反应液植物组织提取液动物组织提取液4“发酵液”“产物”，胞内or胞外？5前处理的目的：对目标组分进行初步富集，对干扰成分进行去除；12.1.1概述2预处理材料的种类和特点3组织62.1.2植物组织提取物的制备*第二章生物样品前处理植物组织材料来源部位不同，前处理方法不同。叶片、根、茎——清洗去泥沙、灰尘等杂质（-4°C——-30°C低温保存备用）；种子（大豆、莲子）、中药提取的原材料等——泡涨，粉碎。2.1.2.1植物组织中酶的提取*第二章生物样品前处理一些酶必须从富含酚、多酚的绿叶、水果和其它组织中提取，大量的分类化合物给提取带来困难。在完整的细胞组织中，酶和酚类物质处于彼此隔离的状态，细胞组织被破坏后，彼此接触，很容易发生酶促反应，反应产物苯醌和单宁类还会继续和酶蛋白质反应，破坏目的酶的活性。所以要在预处理阶段去除酚类化合物。例子：植物组织中二磷酸核酮糖碳酸酶的提取*第二章生物样品前处理1.步骤：100g新鲜叶片→切成小片（打孔器、切片）→置入提取液中（稳定酶活性）→PVPP预浸泡（不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮，可溶性PVP聚乙烯吡咯烷酮，）→间歇高速搅拌（充分接触混匀）→纱布过滤→滤液加入PVPP重复轻搅（重复一次）→离心去除PVPP→酶粗提液。2.条件讨论*第二章生物样品前处理126543低温（4～5度），器皿、溶液预冷、操作要快；5～7倍于固形材料的提取液，搅拌不产生气泡（气泡不利于酶活稳定）；PH6.5~7.0，中性，未知蛋白酶要远离等电点；PVPP优良，不溶性；PPO抑制剂，DTT、2-ME；蛋白酶抑制剂PMSF（苯甲磺酰氟）酒精溶解，剧毒。123456logo多糖提取重要活性多糖步骤：原料→粉碎→醇醚回流脱脂→水提取→粗提液去蛋白策略：Sevag法，蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性TCA法，低浓度的TCA可沉淀蛋白质，离心后即可除去蛋白质。2.1.2.3细菌重组蛋白的提取*第二章生物样品前处理重组蛋白：工程菌可表达大量的重组目的蛋白，40%总蛋白含量，但易形成包涵体（蛋白质以不溶形式包涵在细胞质中）。例：E.coli.中提取重组蛋白*第二章生物样品前处理酶解菌体细胞：离心收集菌体→溶菌酶→去核酸（DNaseⅠ）→电泳检测；ADBC清洗包涵体：去除杂蛋白，保证包涵体蛋白不被溶解；溶解包涵体：释放目的蛋白；